Interaktions- und Funktionsstudien des TGA-Transkriptionsfaktors in dem Lebermoos Marchantia polymorpha:
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Osnabrück
2018
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EINLEITUNG.................................................................................................................6
1.1 MARCHANTIA POLYMORPHA ALS MODELLORGANISMUS
..................................................................
6
1.1.1 EVOLUTION DER
EMBRYOPHYTEN........................................................................................8
1.1.2 MORPHOLOGIE DES MARCHANTIA POLYMORPHA
THALLUS.....................................................9
1.1.3 DER LEBENSZYKLUS VON MARCHANTIA
POLYMORPHA........................................................11
1.2.
TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN.................................................................................................15
1.2.1 TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN WAEHREND DER STRESSANTWORT
........................................
17
1.2.2 TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN BEEINFLUSSEN DIE BLUETENENTWICKLUNG IN
ARABIDOPSIS
THALIANA............................................................................................................
18
1.3 MOTIVATION DER
ARBEIT..........................................................................................................
22
2 MATERIAL UND
METHODEN......................................................................................24
2.1 CHEMIKALIEN, ENZYME, OLIGONUKLEOTIDE UND LOESUNGEN
....................................................
24
2.2 BIOLOGISCHES M
ATERIAL..............................................................................................................24
2.2.1 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON MARCHANTIA
POLYMORPHA..................................................24
2.2.2 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON NICOTIANA
BENTHAMIANA...................................................25
2.2.3
BAKTERIENSTAEMME........................................................................................................
25
2.2.4
HEFEKULTIVIERUNG..........................................................................................................
26
2.2.5
VEKTOREN......................................................................................................................26
2.2.6
ANTIBIOTIKA...................................................................................................................
28
2.3 ISOLATION VON
NUKLEINSAEUREN..................................................................................................29
2.3.1 ISOLATION GENOMISCHER DNA FUER
KLONIERUNGEN...........................................................29
2.3.2 ISOLATION VON
PLASMIDEN..............................................................................................29
2.3.3 ISOLATION VON GESAMT RNA
..........................................................................................
29
2.3.4 CDNA
SYNTHESE............................................................................................................29
2.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR).......................................................................................
29
2.4.1 STANDARD
PCR...............................................................................................................
29
2.4.2
KOLONIE-PCR.................................................................................................................
31
2.4.3 UEBERLAPPENDE
PCR......................................................................................................31
2.4.4 SEMIQUANTITATIVE REVERSE TRANSKRIPTASE-PCR (SQRT-PCR)
........................................
32
2.4.5 QUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR
(QPCR)..............................................................................
33
2.5
DNA-ANALYSEN.........................................................................................................................
34
2.6
IN SILICO
ANALYSEN....................................................................................................................
34
2.7 KLONIERUNG VON
DNA-FRAGMENTEN........................................................................................
35
2.7.1 RESTRIKTION MITTELS
ENDONUKLEASEN............................................................................
35
2.7.2
LIGATION........................................................................................................................
35
2.7.3 GATEWAY BASIERENDE HERSTELLUNG VON EXPRESSIONSVEKTOREN
..................................
35
2.8 HERSTELLUNG VON
UEBEREXPRESSIONSKONSTRUKTEN..................................................................
36
2.8.1 GENERIERUNG VON MPTGA UEBEREXPRESSIONSKONSTRUKTEN
..........................................
36
2.8.2 GENERIERUNG EINES DOMINANTEN MPTGA AKTIVATORS
.................................................
36
2.8.3 GENERIERUNG EINES PROMPTGA:M PTGA-GFP KONSTRUKTS
.............................................
37
2.8.4 GENERIERUNG VON GATEWAY KOMPATIBLEN ZIELVEKTOREN FUER DIE
EXPRESSION VON
N-TERMINALEN MCHERRY
FUSIONSPROTEINEN.........................................................................38
2.8.5 GENERIERUNG EINES
PROMPROXYL:MCHERRY-MPROXYL KONSTRUKTS
........................
39
2.9
TRANSFORMATIONEN....................................................................................................................40
2.9.1 TRANSFORMATION VON ELEKTROKOMPETENTEN BAKTERIENZELLEN
.....................................
40
2.9.2 TRANSFORMATION VON MARCHANTIA
POLYMORPHA..........................................................41
2.9.3 TRANSIENTE TRANSFORMATION VON NICOTIANA BENTHAMIANA
........................................
42
2.9.4 LITHIUMACETAT TRANSFORMATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE
...............................
43
2.10 SS-GALAKTOSIDASE ASSAY AUS
FLUESSIGKULTUREN......................................................................44
2.11 CRISPR/CAS9 INDUZIERTE
GEN-DELETIONEN...........................................................................45
2.11.1 ERZEUGUNG VON CRISPR/CAS9
VEKTOREN....................................................................
46
2.11.2 IDENTIFIZIERUNG VON
MPTGA9E KNOCK-OUT LINIEN
........................................................
48
2.11.3 GENERIERUNG EINES CRISPR RESISTENTEN MPTGA EXPRESSIONSVEKTORS
.....................
49
2.12 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
TECHNIKEN.............................................................................
51
2.12.1 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE KONFOKALE
MIKROSKOPIE...............................................52
2.12.2 FLUORESZENZLEBENSDAUER-MIKROSKOPIE IN NICOTIANA BENTHAMIANA
.........................
52
2.13
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE............................................................................................
54
3
ERGEBNISSE..............................................................................................................56
3.1 IDENTIFIZIERUNG EINES TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTORS IN MARCHANTIA
POLYMORPHA
............
56
3.2 PHYLOGENETISCHE EINORDNUNG DES MPTGA PROTEINS
...........................................................
58
3.3 IN SILICO ANALYSEN WEITERER MPTGA SPLICE-VARIANTEN
......................................................
61
3.4 UNTERSUCHUNGEN VON MOEGLICHEN MPTGA PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN
....................
63
3.4.1 BESTIMMUNG DER PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN DURCH Y2H ASSAYS
........................
64
3.4.2 IN PLANTA PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONSSTUDIEN DURCH DIE BIFC M
ETHODE................69
3.4.3 QUANTIFIZIERUNG DER PROTEIN-PROTEIN INTERAKTION IN PLANTA MITTELS
FRET-FLIM
.......
72
3.5 FUNKTIONALE ANALYSEN VON MPTGA MITTELS UEBEREXPRESSIONSKONSTRUKTEN
...................
85
3.5.1 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER
UEBEREXPRESSIONSLINIEN...................................................86
3.5.2 EXPRESSIONSANALYSE VON PR1 HOMOLOGEN IN UEBEREXPRESSIONSLINIEN
........................
91
3.5.3 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER MPTGA-VP16
LINIEN......................................................92
3.6 FUNKTIONALE ANALYSEN VON MPTGA DURCH VERLUSTMUTANTEN
............................................
95
3.6.1 IDENTIFIKATION VON MPTGO9E LINIEN
..............................................................................
96
3.6.2 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER MPTGOGE
LINIEN............................................................... 98
3.6.3
KOMPLEMENTATIONSEXPERIMENTE...............................................................................102
4
DISKUSSION............................................................................................................107
4.1 TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN EVOLVIERTEN AUS CHAROPHYTISCHEN
VORLAEUFERN................107
4.1.1 EVOLUTION CYSTEINE INNERHALB DER TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
..............................
107
4.1.2 MPTGA KOENNTE DURCH ALTERNATIVES SPLICING REGULIERT WERDEN
...............................
109
4.2 INTERAKTIONSSTUDIEN ZEIGEN INTERAKTION VON MPTGA MIT MPROXYS, MPNPR
UND
MPTGA............................................................................................................................................110
4.2.1 MPROXYL INTERAGIERT STAERKER MIT MPTGA ALS ANDERE UNTERSUCHTE
INTERAKTIONSPARTNER............................................................................................................
111
4.2.2 DIE INTERAKTION VON MPROXYS MIT TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IST IN
DER EVOLUTION
KONSERVIERT..........................................................................................................................113
4.2.3 MPTGA INTERAGIERT IM GESAMTEN ZELLKERN MIT SEINEN
INTERAKTIONSPARTNERN
........
114
4.2.4 DIE INTERAKTION VON MPTGA UND MPROXYL IST ABHAENGIG VON DESSEN
C-TERM INUSLL7
4.2.5 DAS AKTIVE ZENTRUM VON MPROXYL BEEINFLUSST DIE INTERAKTION MIT
MPTGA
........
119
4.3 GENETISCHE STUDIEN ZEIGEN DEN EINFLUSS VON MPTGA AUF DIE MARCHANTIA
POLYMORPHA
MORPHOLOGIE.................................................................................................................................120
4.3.1 DIE MORPHOLOGIE DES MARCHANTIA POLYMORPHA THALLUS IST IN
FUNKTIONSVERLUST- UND
UEBEREXPRESSIONSMUTANTEN
GESTOERT....................................................................................121
4.3.2 MPTGA REGULIERT DIE DIFFERENZIERUNG EINES TRANSPARENTEN ZELLTYPS
IN GEMMAE
NEGATIV.................................................................................................................................122
4.3.3 MPTGA-VP16 LINIEN ZEIGEN EINE ERHOEHTE KAELTESENSITIVITAET
....................................
123
4.3.4 MPTGA IST EIN SCHLUESSELREGULATOR BEI DER INDUKTION VON
GAMETANGIOPHOREN
.....
124
4.3.5 DIE UEBEREXPRESSION VON MPTGA BEEINFLUSST DIE ENTWICKLUNG DER
GAMETANGIOPHOREN............................................................................................................
127
4.3.6 MPTGA REGULIERT DIE EXPRESSION PUTATIVER MPPR1 GENE IN
UEBEREXPRESSIONSLINIEN
130
5
ZUSAMMENFASSUNG..............................................................................................133
5.1
ABSTRACT...................................................................................................................................135
6
AUSBLICK................................................................................................................137
7
LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................139
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS......................................................................................
149
9
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.......................................................................................
152
10 TABELLENVERZEICHNIS
.........................................................................................
154
11
DANKSAGUNG.......................................................................................................155
12
ANHANG...............................................................................................................157
12.1 VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE...........................................................................................
157
12.2 VEKTORKARTEN DER
EXPRESSIONSVEKTOREN...........................................................................162
12.3 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN........................................................169
12.4 SEQUENZVERGLEICH DER STARTREGION AUSGESUCHTER
TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.......
169
12.5 LOKALISATION DER
2INL-KONSTRUKTE.....................................................................................
170
12.6 STREUUNG DER GAMETANGIOPHOREN PHAENOTYPEN IN DER LINIE MPTGAOX L 5
...............
171
12.7 UEBERSICHT UEBER DIE M PTGA9E
LINIEN...................................................................................172
12.8 Y2H ASSAY ZUR HOMODIMERISIERUNG VON
MPTGA............................................................173
12.8
LEBENSLAUF............................................................................................................................174
12.9
PUBLIKATIONSLISTE.................................................................................................................
174
12.10 EIDESSTATTLICHE
ERKLAERUNG.................................................................................................175
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