Holdings: Interaktions- und Funktionsstudien des TGA-Transkriptionsfaktors in dem Lebermoos Marchantia polymorpha

Interaktions- und Funktionsstudien des TGA-Transkriptionsfaktors in dem Lebermoos Marchantia polymorpha:

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Bibliographic Details
Main Author:	Holtmannspötter, Michael 1987- (Author)
Format:	Thesis Book
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Published:	Osnabrück 2018
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adam_text	1 EINLEITUNG.................................................................................................................6 1.1 MARCHANTIA POLYMORPHA ALS MODELLORGANISMUS .................................................................. 6 1.1.1 EVOLUTION DER EMBRYOPHYTEN........................................................................................8 1.1.2 MORPHOLOGIE DES MARCHANTIA POLYMORPHA THALLUS.....................................................9 1.1.3 DER LEBENSZYKLUS VON MARCHANTIA POLYMORPHA........................................................11 1.2. TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN.................................................................................................15 1.2.1 TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN WAEHREND DER STRESSANTWORT ........................................ 17 1.2.2 TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN BEEINFLUSSEN DIE BLUETENENTWICKLUNG IN ARABIDOPSIS THALIANA............................................................................................................ 18 1.3 MOTIVATION DER ARBEIT.......................................................................................................... 22 2 MATERIAL UND METHODEN......................................................................................24 2.1 CHEMIKALIEN, ENZYME, OLIGONUKLEOTIDE UND LOESUNGEN .................................................... 24 2.2 BIOLOGISCHES M ATERIAL..............................................................................................................24 2.2.1 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON MARCHANTIA POLYMORPHA..................................................24 2.2.2 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON NICOTIANA BENTHAMIANA...................................................25 2.2.3 BAKTERIENSTAEMME........................................................................................................ 25 2.2.4 HEFEKULTIVIERUNG.......................................................................................................... 26 2.2.5 VEKTOREN......................................................................................................................26 2.2.6 ANTIBIOTIKA................................................................................................................... 28 2.3 ISOLATION VON NUKLEINSAEUREN..................................................................................................29 2.3.1 ISOLATION GENOMISCHER DNA FUER KLONIERUNGEN...........................................................29 2.3.2 ISOLATION VON PLASMIDEN..............................................................................................29 2.3.3 ISOLATION VON GESAMT RNA .......................................................................................... 29 2.3.4 CDNA SYNTHESE............................................................................................................29 2.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)....................................................................................... 29 2.4.1 STANDARD PCR............................................................................................................... 29 2.4.2 KOLONIE-PCR................................................................................................................. 31 2.4.3 UEBERLAPPENDE PCR......................................................................................................31 2.4.4 SEMIQUANTITATIVE REVERSE TRANSKRIPTASE-PCR (SQRT-PCR) ........................................ 32 2.4.5 QUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR (QPCR).............................................................................. 33 2.5 DNA-ANALYSEN......................................................................................................................... 34 2.6 IN SILICO ANALYSEN.................................................................................................................... 34 2.7 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN........................................................................................ 35 2.7.1 RESTRIKTION MITTELS ENDONUKLEASEN............................................................................ 35 2.7.2 LIGATION........................................................................................................................ 35 2.7.3 GATEWAY BASIERENDE HERSTELLUNG VON EXPRESSIONSVEKTOREN .................................. 35 2.8 HERSTELLUNG VON UEBEREXPRESSIONSKONSTRUKTEN.................................................................. 36 2.8.1 GENERIERUNG VON MPTGA UEBEREXPRESSIONSKONSTRUKTEN .......................................... 36 2.8.2 GENERIERUNG EINES DOMINANTEN MPTGA AKTIVATORS ................................................. 36 2.8.3 GENERIERUNG EINES PROMPTGA:M PTGA-GFP KONSTRUKTS ............................................. 37 2.8.4 GENERIERUNG VON GATEWAY KOMPATIBLEN ZIELVEKTOREN FUER DIE EXPRESSION VON N-TERMINALEN MCHERRY FUSIONSPROTEINEN.........................................................................38 2.8.5 GENERIERUNG EINES PROMPROXYL:MCHERRY-MPROXYL KONSTRUKTS ........................ 39 2.9 TRANSFORMATIONEN....................................................................................................................40 2.9.1 TRANSFORMATION VON ELEKTROKOMPETENTEN BAKTERIENZELLEN ..................................... 40 2.9.2 TRANSFORMATION VON MARCHANTIA POLYMORPHA..........................................................41 2.9.3 TRANSIENTE TRANSFORMATION VON NICOTIANA BENTHAMIANA ........................................ 42 2.9.4 LITHIUMACETAT TRANSFORMATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE ............................... 43 2.10 SS-GALAKTOSIDASE ASSAY AUS FLUESSIGKULTUREN......................................................................44 2.11 CRISPR/CAS9 INDUZIERTE GEN-DELETIONEN...........................................................................45 2.11.1 ERZEUGUNG VON CRISPR/CAS9 VEKTOREN.................................................................... 46 2.11.2 IDENTIFIZIERUNG VON MPTGA9E KNOCK-OUT LINIEN ........................................................ 48 2.11.3 GENERIERUNG EINES CRISPR RESISTENTEN MPTGA EXPRESSIONSVEKTORS ..................... 49 2.12 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE TECHNIKEN............................................................................. 51 2.12.1 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE KONFOKALE MIKROSKOPIE...............................................52 2.12.2 FLUORESZENZLEBENSDAUER-MIKROSKOPIE IN NICOTIANA BENTHAMIANA ......................... 52 2.13 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE............................................................................................ 54 3 ERGEBNISSE..............................................................................................................56 3.1 IDENTIFIZIERUNG EINES TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTORS IN MARCHANTIA POLYMORPHA ............ 56 3.2 PHYLOGENETISCHE EINORDNUNG DES MPTGA PROTEINS ........................................................... 58 3.3 IN SILICO ANALYSEN WEITERER MPTGA SPLICE-VARIANTEN ...................................................... 61 3.4 UNTERSUCHUNGEN VON MOEGLICHEN MPTGA PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN .................... 63 3.4.1 BESTIMMUNG DER PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN DURCH Y2H ASSAYS ........................ 64 3.4.2 IN PLANTA PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONSSTUDIEN DURCH DIE BIFC M ETHODE................69 3.4.3 QUANTIFIZIERUNG DER PROTEIN-PROTEIN INTERAKTION IN PLANTA MITTELS FRET-FLIM ....... 72 3.5 FUNKTIONALE ANALYSEN VON MPTGA MITTELS UEBEREXPRESSIONSKONSTRUKTEN ................... 85 3.5.1 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER UEBEREXPRESSIONSLINIEN...................................................86 3.5.2 EXPRESSIONSANALYSE VON PR1 HOMOLOGEN IN UEBEREXPRESSIONSLINIEN ........................ 91 3.5.3 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER MPTGA-VP16 LINIEN......................................................92 3.6 FUNKTIONALE ANALYSEN VON MPTGA DURCH VERLUSTMUTANTEN ............................................ 95 3.6.1 IDENTIFIKATION VON MPTGO9E LINIEN .............................................................................. 96 3.6.2 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER MPTGOGE LINIEN............................................................... 98 3.6.3 KOMPLEMENTATIONSEXPERIMENTE...............................................................................102 4 DISKUSSION............................................................................................................107 4.1 TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN EVOLVIERTEN AUS CHAROPHYTISCHEN VORLAEUFERN................107 4.1.1 EVOLUTION CYSTEINE INNERHALB DER TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN .............................. 107 4.1.2 MPTGA KOENNTE DURCH ALTERNATIVES SPLICING REGULIERT WERDEN ............................... 109 4.2 INTERAKTIONSSTUDIEN ZEIGEN INTERAKTION VON MPTGA MIT MPROXYS, MPNPR UND MPTGA............................................................................................................................................110 4.2.1 MPROXYL INTERAGIERT STAERKER MIT MPTGA ALS ANDERE UNTERSUCHTE INTERAKTIONSPARTNER............................................................................................................ 111 4.2.2 DIE INTERAKTION VON MPROXYS MIT TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IST IN DER EVOLUTION KONSERVIERT..........................................................................................................................113 4.2.3 MPTGA INTERAGIERT IM GESAMTEN ZELLKERN MIT SEINEN INTERAKTIONSPARTNERN ........ 114 4.2.4 DIE INTERAKTION VON MPTGA UND MPROXYL IST ABHAENGIG VON DESSEN C-TERM INUSLL7 4.2.5 DAS AKTIVE ZENTRUM VON MPROXYL BEEINFLUSST DIE INTERAKTION MIT MPTGA ........ 119 4.3 GENETISCHE STUDIEN ZEIGEN DEN EINFLUSS VON MPTGA AUF DIE MARCHANTIA POLYMORPHA MORPHOLOGIE.................................................................................................................................120 4.3.1 DIE MORPHOLOGIE DES MARCHANTIA POLYMORPHA THALLUS IST IN FUNKTIONSVERLUST- UND UEBEREXPRESSIONSMUTANTEN GESTOERT....................................................................................121 4.3.2 MPTGA REGULIERT DIE DIFFERENZIERUNG EINES TRANSPARENTEN ZELLTYPS IN GEMMAE NEGATIV.................................................................................................................................122 4.3.3 MPTGA-VP16 LINIEN ZEIGEN EINE ERHOEHTE KAELTESENSITIVITAET .................................... 123 4.3.4 MPTGA IST EIN SCHLUESSELREGULATOR BEI DER INDUKTION VON GAMETANGIOPHOREN ..... 124 4.3.5 DIE UEBEREXPRESSION VON MPTGA BEEINFLUSST DIE ENTWICKLUNG DER GAMETANGIOPHOREN............................................................................................................ 127 4.3.6 MPTGA REGULIERT DIE EXPRESSION PUTATIVER MPPR1 GENE IN UEBEREXPRESSIONSLINIEN 130 5 ZUSAMMENFASSUNG..............................................................................................133 5.1 ABSTRACT...................................................................................................................................135 6 AUSBLICK................................................................................................................137 7 LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................139 8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS...................................................................................... 149 9 ABBILDUNGSVERZEICHNIS....................................................................................... 152 10 TABELLENVERZEICHNIS ......................................................................................... 154 11 DANKSAGUNG.......................................................................................................155 12 ANHANG...............................................................................................................157 12.1 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE........................................................................................... 157 12.2 VEKTORKARTEN DER EXPRESSIONSVEKTOREN...........................................................................162 12.3 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIENZELLEN........................................................169 12.4 SEQUENZVERGLEICH DER STARTREGION AUSGESUCHTER TGA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN ....... 169 12.5 LOKALISATION DER 2INL-KONSTRUKTE..................................................................................... 170 12.6 STREUUNG DER GAMETANGIOPHOREN PHAENOTYPEN IN DER LINIE MPTGAOX L 5 ............... 171 12.7 UEBERSICHT UEBER DIE M PTGA9E LINIEN...................................................................................172 12.8 Y2H ASSAY ZUR HOMODIMERISIERUNG VON MPTGA............................................................173 12.8 LEBENSLAUF............................................................................................................................174 12.9 PUBLIKATIONSLISTE................................................................................................................. 174 12.10 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG.................................................................................................175
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