Holdings: Der Milchsaft von Papaver somniferum

Der Milchsaft von Papaver somniferum: die Proteinanalyse als Ansatz zur Funktionsanalyse

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Bibliographic Details
Main Author:	Decker, Gabriele Theresia 1972- (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	2001
Subjects:	Schlafmohn - Milchsaft - Proteomanalyse Milchsaft Schlafmohn Proteomanalyse Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS I INHALTSVERZEICHNIS I. EINLEITUNG . 1 1. PAPAVER SOMNIFERUM: STAND DER FORSCHUNG . 1 2. PROTEOMICS - EIN NEUER ANSATZ IN DER BIOANALYTIK . 24 3. KURZER UEBERBLICK UEBER ZWEI ELEKTROPHORETISCHE METHODEN: ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE UND KAPILLARELEKTROPHORESE . 32 4. AUFGABENSTELLUNG DIESER ARBEIT . 39 IL MATERIAL . 40 1. PFLANZLICHES MATERIAL . 40 1.1 PFLANZEN . 40 1.2 ZELLSUSPENSIONSKULTUREN . 41 2. CHEMIKALIEN . 41 3. GERAETE . 43 HI. METHODEN . 46 1. GEWINNUNG UND AUFARBEITUNG VON PFLANZEN - LATICES . 46 1.1 HERSTELLUNG VON PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX-FRAKTIONEN . 46 1.1.1 GEWINNUNG VON PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX . 47 1.1.2 FRAKTIONIERUNG DES PAPAVER SOMNIFERUM - MILCHSAFTES . 47 1.1.3 AUFTRENNUNG DES PAPAVER SOMNIFERUM - VESIKELPELLETS UEBER ZUCKERDICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION . 48 1.1.4 CYTOSOLISCHER ANTEIL VON GESAMTLATEX, VESIKELPELLET UND DEN EINZELNEN VESIKELFRAKTIONEN . 48 1.1.5 VERSCHIEDENE ANSAETZE ZUR SOLUBILISIERUNG UND EXTRAKTION VON PAPAVER SOMNIFERUM - VESIKELMEMBRANEN . 49 1.2 MILCHSAFT VON WEITEREN PAPAVER - ARTEN . 54 1.3 MILCHSAFT VON PAPAVER SOMNIFERUM - MUTANTEN . 54 1.4 LATEX VON WEITEREN MILCHSAFTFUEHRENDEN PFLANZEN . 54 1.4.1 MILCHSAFT VON HEVEA BRASILIENSIS . 54 1.4.2 MILCHSAFT VON EUPHORBIA TIRUCALLI . 54 2. EXTRAKTION VON PFLANZLICHEM MATERIAL . 54 2.1 PFLANZEN UND PFLANZENTEILE . 54 2.2 PAPAVER SOMNIFERUM - ZELLSUSPENSIONSKULTUR . 55 3. KAPILLARELEKTROPHORESE (CE) . 55 3.1 VORBEREITUNG . 55 3.2 NICHTWAESSRIGE CE-METHODE (NACE) ZUM NACHWEIS VON ALKALOIDEN . 57 3.3 WAESSRIGE METHODE ZUM SIMULTANEN NACHWEIS VON PFLANZENSAEUREN UND ALKALOIDEN . 58 4. PROTEINBESTIMMUNG . 59 5. ACETON-TCA-PROTEINFAELLUNG . 59 6. GELELEKTROPHORESE . 59 6.1 HERSTELLUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN . 60 6.1.1 HOMOGEN VERNETZTE POLYACRYLAMIDGELE . 60 6.1.1.1 SDS-GELE . 60 INHALTSVERZEICHNIS II 6.1.1.2 NATIVE GELE . 62 6.1.2 HERSTELLUNG VON GRADIENTENGELEN MIT T = 9-16% . 62 6.1.3 HERSTELLEN VON IMMOBILISIERTEN PH-GRADIENTENGELEN (IPG-GELEN) . 64 6.1.4 EINDIMENSIONALE SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (1 D-SDS PAGE) . 67 6.1.5 SDS-1D-PAGE . 67 6.1.6 NATIVE ID-PAGE . 67 6.2 ZWEIDIMENSIONALE SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (2D-SDS-PAGE) . 67 6.2.1 PROBENVORBEREITUNG . 68 6.2.2 EINGESETZTE PROBENMENGEN . 69 6.2.3 ERSTE DIMENSION: ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF) . 69 6.2.4 AEQUILIBRIERUNG DER IPG-STREIFEN . 71 6.2.5 ZWEITE DIMENSION: SDS-PAGE . 72 7. GELFAERBUNGEN . 73 7.1 COOMASSIE-FAERBUNG . 73 7.2 SILBERFAERBUNG . 74 7.2.1 SILBERFAERBUNG NACH HEUKESHOVEN, MODIFIZIERT . 74 7.2.2 SILBERFAERBUNG NACH HOCHSTRASSER . 75 8. DETEKTION VON POLYPHENOLOXIDASE IM GEL . 76 8.1 PHENOLASE-NACHWEIS MIT DOPAMIN-LOESUNG . 76 8.2 PHENOLASE-NACHWEIS MIT 4-TERT-BUTYLCATECHOL ALS SUBSTRAT. 76 9. COMPUTERUNTERSTUETZTE AUSWERTUNG DER GELE . 76 9.1 DATENAUFNAHME . 76 9.2 GELAUSWERTUNG UND GELVERGLEICH . 77 10. ENZYMATISCHE SPALTUNG VON PROTEINEN IM GEL . 77 11. HOCHAUFLOESENDE FLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE (HPLC) . 79 12. AMINOSAEURESEQUENZANALYSE . 79 13. MASSENSPEKTROMETRIE . 80 14. DATENBANKRECHERCHE. 80 15. ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 80 IV. ERGEBNISSE . 82 TEIL A GRUNDLEGENDE BEOBACHTUNGEN.83 1. BEOBACHTUNGEN BEI DER FRAKTIONIERUNG VON PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX . 83 1.1 YYVOLUMENVERHAELTNIS " VON SERUM BZW. URSPRUENGLICHEM CYTOPLASMA UND VESIKELPELLET . 83 1.2 VERTEILUNG DER VESIKULAEREN ORGANELLEN BEI DER DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION . 85 2. PHAENOTYP VON PAPAVER SOMNIFERUM -'NUEDTYPUAD PAPAVER SOMNIFERUM - MUTANTEN . 86 TEIL B UNTERSUCHUNGEN VON NIEDERMOLEKULAREN INHALTSSTOFFEN MITTELS KAPILLARELEKTROPHORESE (CE) _ 87 1. METHODENENTWICKLUNG UND -OPTIMIERUNG . 87 1.1 NACE (NON-AQUEOUS CAPILLARY ELECTROPHORESIS) VON ALKALOIDEN UND VORSTUFEN . 87 1.1.1 AUFGETRENNTE REFERENZSUBSTANZEN . 87 1.1.2 QUANTIFIZIERUNG . 89 INHALTSVERZEICHNIS III 1.1.3 EINSATZBEREICH . 89 1.2 WAESSRIGE KAPILLARELEKTROPHORESE DER PFLANZENSAEUREN CHELIDONSAEURE UND MEKONSAEURE, UND EINIGER ALKALOIDE . 89 1.2.1 AUFGETRENNTE REFERENZSUBSTANZEN . 90 1.2.2 QUANTIFIZIERUNG . 91 1.3 ANMERKUNG ZU DEN KAPILLARELEKTROPHORETISCHEN METHODEN . 92 2. QUALITATIVE UND QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON ALKALOIDEN IM MILCHSAFT VON PAPAVER SOMNIFERUM UND DARAUS ISOLIERTEN FRAKTIONEN MITTELS NACE . 93 2.1 ALKALOIDMUSTER IN PAPAVER SOMNIFERUM - SERUM UND - VESIKELCYTOSOL . 93 2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUM ALKALOIDGEHALT IM SERUM UND VESIKELCYTOSOL. 94 2.2.1 KINETIKSTUDIE: ALKALOIDMENGEN IN SERUM UND VESIKELCYTOSOL . 94 2.2.2 VERHAELTNIS DER ALKALOIDMETABOLITEN BEZOGEN AUF DAS HAUPTALKALOID MORPHIN . 96 2.2.3 ALKALOID UND PROTEINVERTEILUNG IM PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX . 98 2.3 VESIKELFTAKTIONEN . 99 3. ALKALOIDENTWICKLUNG IN WURZEL UND SPROSS HERANWACHSENDER PAPAVER SOMNIFERUM - PFLANZEN . 102 4. MUTANTEN VON PAPAVER SOMNIFERUM'. ALKALOIDMUSTER IN DEN SEREN . 104 4.1 QUALITATIVES SCREENING VON MUTANTEN - SEREN . 104 4.2 QUANTITATIVE BETRACHTUNG DER MUTANTEN - SEREN . 105 5. UNTERSUCHUNGEN ZUR MEKONSAEURE . 106 5.1 MEKONSAEURE IM LATEX VON PAPAVER SOMNIFERUM . 106 5.2 STUDIEN ZUR MEKONSAEURE-MORPHIN-VERTEILUNG IN PAPAVER SOMNIFERUM - VESIKELCYTOSOL UND - SERUM . 107 5.3 MEKONSAEUREGEHALT IN DEN EINZELNEN V ESIKELFTAKTIONEN . 109 6. WEITERE APPLIKATIONEN DER CE-METHODEN . 110 6.1 ALKALOIDMUSTER IN PAPAVER SOMNIFERUM - ZELLKULTUR . 110 6.2 ALKALOIDE IM MILCHSAFT DER PAPAVER - ARTEN PAPAVER SETIGERUM UND PAPAVER BRACTEATUM . 111 TEIL C UNTERSUCHUNGEN ZUR PROTEINAUSSTATTUNG IM MILCHSAFT VON PAPAVER SOMNIFERUM, PAPAVER SOMNIFERUM - MUTANTEN UND ANDEREN MILCHSAFTFUEHRENDEN ARTEN . 113 1. VORVERSUCHE ZUR PROTEINVERTEILUNG IM LATEX VON PAPAVER SOMNIFERUM . 113 1.1 PROTEINGEHALT . 113 1.2 PROTEINVERTEILUNG IN DEN VESIKELFRAKTIONEN . 113 1.3 EINDIMENSIONALES PROTEINBANDENMUSTER . 114 2. ANALYTISCHE ZWEIDIMENSIONALE AUFTRENNUNG LOESLICHER PROTEINE AUS PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX UND DARAUS ISOLIERTEN FRAKTIONEN . 115 2.1 GELSYSTEM UND VERSUCHSPARAMETER . 115 2.2 2D-SDS-PAGE LOESLICHER PROTEINE VON LATEX, SERUM UND VESIKELPELLET . 116 2.2.1 UNTERSCHIEDE IM PROTEINMUSTER . 116 2.2.2 COMPUTERUNTERSTUETZTE AUSWERTUNG DIESER GELE . 118 2.2.2.1 SPOTDETEKTION UND SPOTZUORDNUNG . 118 2.2.2.2 VERGLEICHENDE SPOTANALYSE VON GESAMTVESIKELCYTOSOL ZU SERUM . 119 2.3 2D-SDS-PAGE EINZELNER VESIKELFRAKTIONEN . 121 2.3.1 UNTERSCHIEDE IM PROTEINEXPRESSIONSMUSTER DER EINZELNEN VESIKELFRAKTIONEN . 124 2.3.2 COMPUTERUNTERSTUETZTE AUSWERTUNG DIESER GELE . 128 INHALTSVERZEICHNIS IV 2.3.2.1 SPOTERKENNUNG UND ZUORDNUNG IM GELVERGLEICH . 128 2.3.2.2 BILDUNG EINES SYNTHETISCHEN GELS AUS DEN GELEN DER EINZELNEN VESIKELCYTOSOLE . 128 3. IDENTIFIZIERUNG UND KARTIERUNG VON PAPAVER SOMNIFERUM - LATEXPROTEINEN . 131 3.1 PRAEPARATIVE GELE . 131 3.2 PROTEINCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG DURCH VERGLEICHE MIT DATENBANKEINTRAGUNGEN . 132 3.3 CHARAKTERISIERTE PROTEINE VON PAPAVER SOMNIFERUM - SERUM . 133 3.4 CHARAKTERISIERTE VESIKULAERE PROTEINE VON PAPAVER SOMNIFERUM . 138 4. ERSTE UNTERSUCHUNGEN ZUM MEMBRANHALTIGEN ANTEIL DES 1000 X G VESIKELPELLETS AUS PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX . 141 4.1 1 D-SDS-PAGE EINZELNER SOLUBILISIERUNGSEXTRAKTE . 141 4.2 2D-SDS-PAGE EINZELNER SOLUBILISIERUNGSEXTRAKTE . 142 4.3 PRAEPARATIVE 1 D-SDS-PAGE UND DARAUS CHARAKTERISIERTE PROTEINE . 144 5. NACHWEIS DER PHENOLOXIDASE VON PAPAVER SOMNIFERUM IM GEL . 146 6. PROTEOMANSATZ MIT MUTANTEN VON PAPAVER SOMNIFERUM . 148 6.1 IDEE DIESES PROTEOMVERGLEICHES . 148 6.2 MUTANTEN - SEREN IM UEBERBLICK . 148 6.3 STUDIEN ZUR WAHL DES PH-BEREICHES IN DER ERSTEN DIMENSION . 150 6.4 PROTEOMANALYTISCHER ANSATZ ZU DEN MUTANTEN - SEREN IM GESPREITZTEN PH GRADIENTEN-BEREICH VON PH 4-6 UND PH 5.5-7.5 . 152 6.4.1 GEWAEHLTES GELSYSTEM . 152 6.4.2 ANALYTISCHE ZWEIDIMENSIONALE GELE VON DEN MUTANTEN - SEREN . 153 6.4.3 COMPUTERUNTERSTUETZTE AUSWERTUNG DER ZWEIDIMENSIONAL AUFGETRENNTEN PROTEINEXPRESSIONSMUSTER . 154 6.4.3.1 SPOTDETEKTION UND SPOTZUORDNUNG . 154 6.4.3.2 BETRACHTUNG DER MUTANTEN - SEREN BEZUEGLICH DER QUANTITATIVEN PROTEINEXPRESSION . 155 6.4.4 PAPAVER SOMNIFERUM - MUTANTEN UND PAPAVER SOMNIFERUM - WILDTYP: UNTERSCHIEDE IM PROTEINSPOTMUSTER DER SEREN IM DETAIL BETRACHTET . 160 6.4.4.1 BEISPIELE AUS DER QUANTITATIVEN AUSWERTUNG . 160 6.4.4.2 UNTERSCHIEDE IM BEREICH DER MLPS (MAJOR LATEX PROTEINE) . 167 6.5 CHARAKTERISIERUNG EINIGER PROTEINE . 168 6.5.1 IDENTIFIZIERUNG UEBER EDMAN-SEQUENZIERUNG . 169 6.5.2 IDENTIFIZIERUNG UEBER MALDI-MASSEN-YINGERPRZNZ . 169 7. PROTEINZUSAMMENSETZUNG IN DEN LATICES ZWEIER WEITERER PAPAVER - ARTEN: PAPAVER BRACTEATUM UND PAPAVER SETIGERUM . 171 7.1 PAPAVER BRACTEATUM'. PROTEINMUSTER DES SERUMS IM UEBERBLICK . 171 7.2 PAPAVER SETIGERUM UND PAPAVER SOMNIFERUM: DAS YYLATEX-PROTEOM " ZWEIER MORPHINPRODUZENTEN IM VERGLEICH . 174 8. PROTEINZUSAMMENSETZUNG ANDERER LATICES . 176 8.1 1 D-SDS-PAGE VON HEVEA BRASILIENSIS - UND EUPHORBIA TIRUCALLI - LATEX . 177 8.2 ANALYTISCHE ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE VON HEVEA BRASILIENSIS - LATEX . 178 TEIL D UNTERSUCHUNGEN ZUR ULTRASTRUKTUR DES MILCHSAFTES UND DER MILCHROEHREN MITTELS ELEKTRONEN MIKROSKOPIE _ _ . _ _ . _ 180 1. MILCHROEHREN . 180 2. STUDIEN ZUM ISOLIERTEN MILCHSAFT . 183 INHALTSVERZEICHNIS V 2.1 ULTRASTRUKTUR DES ISOLIERTEN MILCHSAFTES . 183 2.2 VESIKELFRAKTIONEN UNTERSCHIEDLICHER DICHTE . 184 2.3 VESIKEL MIT YYKAPPEN " . 186 V. DISKUSSION . 189 1. SEKUNDAERSTOFFE UND DEREN METABOLISMUS - DIE PROTEINAUSSTATTUNG ALS METHODISCH-ANALYTISCHER ANSATZPUNKT . 189 2. PAPAVER SOMNIFERUM - LATEX: EIN BLICK IN ULTRASTRUKTUR UND SEKUNDAERSTOFFMUSTER . 191 3. DIE PROTEINAUSSTATTUNG IM PAPAVER SOWM/ERAW-MILCHSAFT . 194 3.1 DIE PROTEINMUSTER VON GESAMTLATEX, SERUM, GESAMTVESIKELPELLET UND VESIKELFRAKTIONEN . 194 3.2 IDENTIFIZIERTE PROTEINE UND DEREN MOEGLICHE FUNKTIONEN IM PAPAVER SOMNIFERUM - MILCHSAFT . 196 3.3 UNTERSUCHUNG DES MEMBRANHALTIGEN ANTEILS DES 1000 X G - VESIKELPELLETS . 206 4. UNTERSUCHUNG WEITERER MILCHSAEFTE . 209 4.1 VERGLEICH MIT MILCHSAEFTEN ANDERER PAPAVER - ARTEN BZW. PFLANZENFAMILIEN . 209 4.2 PROTEOMANALYTISCHER ANSATZ MIT PAPAVER SOMNIFERUM - MUTANTEN . 210 VI. ZUSAMMENFASSUNG . 214 VII. ANHANG . 218 1. KURZSCHREIBWEISEN FTLR DIE PROTEINOGENEN AMINOSAEUREN . 218 2. STRUKTURFORMELN DER VERWENDETEN REFERENZSUBSTANZEN . 219 3. AUSWERTUNG DES PROTEOMANALYTISCHEN ANSATZES DER MUTANTEN - SEREN . 220 VHI. LITERATURVERZEICHNIS . 229
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