Der Milchsaft von Papaver somniferum: die Proteinanalyse als Ansatz zur Funktionsanalyse
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2001
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | VII, 241 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
.
1
1.
PAPAVER
SOMNIFERUM:
STAND
DER
FORSCHUNG
.
1
2.
PROTEOMICS
-
EIN
NEUER
ANSATZ
IN
DER
BIOANALYTIK
.
24
3.
KURZER
UEBERBLICK
UEBER
ZWEI
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN:
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
UND
KAPILLARELEKTROPHORESE
.
32
4.
AUFGABENSTELLUNG
DIESER
ARBEIT
.
39
IL
MATERIAL
.
40
1.
PFLANZLICHES
MATERIAL
.
40
1.1
PFLANZEN
.
40
1.2
ZELLSUSPENSIONSKULTUREN
.
41
2.
CHEMIKALIEN
.
41
3.
GERAETE
.
43
HI.
METHODEN
.
46
1.
GEWINNUNG
UND
AUFARBEITUNG
VON
PFLANZEN
-
LATICES
.
46
1.1
HERSTELLUNG
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX-FRAKTIONEN
.
46
1.1.1
GEWINNUNG
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX
.
47
1.1.2
FRAKTIONIERUNG
DES
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MILCHSAFTES
.
47
1.1.3
AUFTRENNUNG
DES
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
VESIKELPELLETS
UEBER
ZUCKERDICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
48
1.1.4
CYTOSOLISCHER
ANTEIL
VON
GESAMTLATEX,
VESIKELPELLET
UND
DEN
EINZELNEN
VESIKELFRAKTIONEN
.
48
1.1.5
VERSCHIEDENE
ANSAETZE
ZUR
SOLUBILISIERUNG
UND
EXTRAKTION
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
VESIKELMEMBRANEN
.
49
1.2
MILCHSAFT
VON
WEITEREN
PAPAVER
-
ARTEN
.
54
1.3
MILCHSAFT
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MUTANTEN
.
54
1.4
LATEX
VON
WEITEREN
MILCHSAFTFUEHRENDEN
PFLANZEN
.
54
1.4.1
MILCHSAFT
VON
HEVEA
BRASILIENSIS
.
54
1.4.2
MILCHSAFT
VON
EUPHORBIA
TIRUCALLI
.
54
2.
EXTRAKTION
VON
PFLANZLICHEM
MATERIAL
.
54
2.1
PFLANZEN
UND
PFLANZENTEILE
.
54
2.2
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
ZELLSUSPENSIONSKULTUR
.
55
3.
KAPILLARELEKTROPHORESE
(CE)
.
55
3.1
VORBEREITUNG
.
55
3.2
NICHTWAESSRIGE
CE-METHODE
(NACE)
ZUM
NACHWEIS
VON
ALKALOIDEN
.
57
3.3
WAESSRIGE
METHODE
ZUM
SIMULTANEN
NACHWEIS
VON
PFLANZENSAEUREN
UND
ALKALOIDEN
.
58
4.
PROTEINBESTIMMUNG
.
59
5.
ACETON-TCA-PROTEINFAELLUNG
.
59
6.
GELELEKTROPHORESE
.
59
6.1
HERSTELLUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
60
6.1.1
HOMOGEN
VERNETZTE
POLYACRYLAMIDGELE
.
60
6.1.1.1
SDS-GELE
.
60
INHALTSVERZEICHNIS
II
6.1.1.2
NATIVE
GELE
.
62
6.1.2
HERSTELLUNG
VON
GRADIENTENGELEN
MIT
T
=
9-16%
.
62
6.1.3
HERSTELLEN
VON
IMMOBILISIERTEN
PH-GRADIENTENGELEN
(IPG-GELEN)
.
64
6.1.4
EINDIMENSIONALE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(1
D-SDS
PAGE)
.
67
6.1.5
SDS-1D-PAGE
.
67
6.1.6
NATIVE
ID-PAGE
.
67
6.2
ZWEIDIMENSIONALE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(2D-SDS-PAGE)
.
67
6.2.1
PROBENVORBEREITUNG
.
68
6.2.2
EINGESETZTE
PROBENMENGEN
.
69
6.2.3
ERSTE
DIMENSION:
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
.
69
6.2.4
AEQUILIBRIERUNG
DER
IPG-STREIFEN
.
71
6.2.5
ZWEITE
DIMENSION:
SDS-PAGE
.
72
7.
GELFAERBUNGEN
.
73
7.1
COOMASSIE-FAERBUNG
.
73
7.2
SILBERFAERBUNG
.
74
7.2.1
SILBERFAERBUNG
NACH
HEUKESHOVEN,
MODIFIZIERT
.
74
7.2.2
SILBERFAERBUNG
NACH
HOCHSTRASSER
.
75
8.
DETEKTION
VON
POLYPHENOLOXIDASE
IM
GEL
.
76
8.1
PHENOLASE-NACHWEIS
MIT
DOPAMIN-LOESUNG
.
76
8.2
PHENOLASE-NACHWEIS
MIT
4-TERT-BUTYLCATECHOL
ALS
SUBSTRAT.
76
9.
COMPUTERUNTERSTUETZTE
AUSWERTUNG
DER
GELE
.
76
9.1
DATENAUFNAHME
.
76
9.2
GELAUSWERTUNG
UND
GELVERGLEICH
.
77
10.
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
PROTEINEN
IM
GEL
.
77
11.
HOCHAUFLOESENDE
FLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
.
79
12.
AMINOSAEURESEQUENZANALYSE
.
79
13.
MASSENSPEKTROMETRIE
.
80
14.
DATENBANKRECHERCHE.
80
15.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
80
IV.
ERGEBNISSE
.
82
TEIL
A
GRUNDLEGENDE
BEOBACHTUNGEN.83
1.
BEOBACHTUNGEN
BEI
DER
FRAKTIONIERUNG
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX
.
83
1.1
YYVOLUMENVERHAELTNIS
"
VON
SERUM
BZW.
URSPRUENGLICHEM
CYTOPLASMA
UND
VESIKELPELLET
.
83
1.2
VERTEILUNG
DER
VESIKULAEREN
ORGANELLEN
BEI
DER
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
85
2.
PHAENOTYP
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-'NUEDTYPUAD
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MUTANTEN
.
86
TEIL
B
UNTERSUCHUNGEN
VON
NIEDERMOLEKULAREN
INHALTSSTOFFEN
MITTELS
KAPILLARELEKTROPHORESE
(CE)
_
87
1.
METHODENENTWICKLUNG
UND
-OPTIMIERUNG
.
87
1.1
NACE
(NON-AQUEOUS
CAPILLARY
ELECTROPHORESIS)
VON
ALKALOIDEN
UND
VORSTUFEN
.
87
1.1.1
AUFGETRENNTE
REFERENZSUBSTANZEN
.
87
1.1.2
QUANTIFIZIERUNG
.
89
INHALTSVERZEICHNIS
III
1.1.3
EINSATZBEREICH
.
89
1.2
WAESSRIGE
KAPILLARELEKTROPHORESE
DER
PFLANZENSAEUREN
CHELIDONSAEURE
UND
MEKONSAEURE,
UND
EINIGER
ALKALOIDE
.
89
1.2.1
AUFGETRENNTE
REFERENZSUBSTANZEN
.
90
1.2.2
QUANTIFIZIERUNG
.
91
1.3
ANMERKUNG
ZU DEN
KAPILLARELEKTROPHORETISCHEN
METHODEN
.
92
2.
QUALITATIVE
UND
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
ALKALOIDEN
IM
MILCHSAFT
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
UND
DARAUS
ISOLIERTEN
FRAKTIONEN
MITTELS
NACE
.
93
2.1
ALKALOIDMUSTER
IN
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
SERUM
UND
-
VESIKELCYTOSOL
.
93
2.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
ALKALOIDGEHALT
IM
SERUM
UND
VESIKELCYTOSOL.
94
2.2.1
KINETIKSTUDIE:
ALKALOIDMENGEN
IN
SERUM
UND
VESIKELCYTOSOL
.
94
2.2.2
VERHAELTNIS
DER
ALKALOIDMETABOLITEN
BEZOGEN
AUF
DAS
HAUPTALKALOID
MORPHIN
.
96
2.2.3
ALKALOID
UND
PROTEINVERTEILUNG
IM
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX
.
98
2.3
VESIKELFTAKTIONEN
.
99
3.
ALKALOIDENTWICKLUNG
IN
WURZEL
UND
SPROSS
HERANWACHSENDER
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
PFLANZEN
.
102
4.
MUTANTEN
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM'.
ALKALOIDMUSTER
IN
DEN
SEREN
.
104
4.1
QUALITATIVES
SCREENING
VON
MUTANTEN
-
SEREN
.
104
4.2
QUANTITATIVE
BETRACHTUNG
DER
MUTANTEN
-
SEREN
.
105
5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MEKONSAEURE
.
106
5.1
MEKONSAEURE
IM
LATEX
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
.
106
5.2
STUDIEN
ZUR
MEKONSAEURE-MORPHIN-VERTEILUNG
IN
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
VESIKELCYTOSOL
UND
-
SERUM
.
107
5.3
MEKONSAEUREGEHALT
IN
DEN
EINZELNEN
V
ESIKELFTAKTIONEN
.
109
6.
WEITERE
APPLIKATIONEN
DER
CE-METHODEN
.
110
6.1
ALKALOIDMUSTER
IN
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
ZELLKULTUR
.
110
6.2
ALKALOIDE
IM
MILCHSAFT
DER
PAPAVER
-
ARTEN
PAPAVER
SETIGERUM
UND
PAPAVER
BRACTEATUM
.
111
TEIL
C
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEINAUSSTATTUNG
IM
MILCHSAFT
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM,
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MUTANTEN
UND
ANDEREN
MILCHSAFTFUEHRENDEN
ARTEN
.
113
1.
VORVERSUCHE
ZUR
PROTEINVERTEILUNG
IM
LATEX
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
.
113
1.1
PROTEINGEHALT
.
113
1.2
PROTEINVERTEILUNG
IN
DEN
VESIKELFRAKTIONEN
.
113
1.3
EINDIMENSIONALES
PROTEINBANDENMUSTER
.
114
2.
ANALYTISCHE
ZWEIDIMENSIONALE
AUFTRENNUNG
LOESLICHER
PROTEINE
AUS
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX
UND
DARAUS
ISOLIERTEN
FRAKTIONEN
.
115
2.1
GELSYSTEM
UND
VERSUCHSPARAMETER
.
115
2.2
2D-SDS-PAGE
LOESLICHER
PROTEINE
VON
LATEX,
SERUM
UND
VESIKELPELLET
.
116
2.2.1
UNTERSCHIEDE
IM
PROTEINMUSTER
.
116
2.2.2
COMPUTERUNTERSTUETZTE
AUSWERTUNG
DIESER
GELE
.
118
2.2.2.1
SPOTDETEKTION
UND
SPOTZUORDNUNG
.
118
2.2.2.2
VERGLEICHENDE
SPOTANALYSE
VON
GESAMTVESIKELCYTOSOL
ZU
SERUM
.
119
2.3
2D-SDS-PAGE
EINZELNER
VESIKELFRAKTIONEN
.
121
2.3.1
UNTERSCHIEDE
IM
PROTEINEXPRESSIONSMUSTER
DER
EINZELNEN
VESIKELFRAKTIONEN
.
124
2.3.2
COMPUTERUNTERSTUETZTE
AUSWERTUNG
DIESER
GELE
.
128
INHALTSVERZEICHNIS
IV
2.3.2.1
SPOTERKENNUNG
UND
ZUORDNUNG
IM
GELVERGLEICH
.
128
2.3.2.2
BILDUNG
EINES
SYNTHETISCHEN
GELS
AUS
DEN
GELEN
DER
EINZELNEN
VESIKELCYTOSOLE
.
128
3.
IDENTIFIZIERUNG
UND
KARTIERUNG
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEXPROTEINEN
.
131
3.1
PRAEPARATIVE
GELE
.
131
3.2
PROTEINCHEMISCHE
IDENTIFIZIERUNG
DURCH
VERGLEICHE
MIT
DATENBANKEINTRAGUNGEN
.
132
3.3
CHARAKTERISIERTE
PROTEINE
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
SERUM
.
133
3.4
CHARAKTERISIERTE
VESIKULAERE
PROTEINE
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
.
138
4.
ERSTE
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
MEMBRANHALTIGEN
ANTEIL
DES
1000
X
G
VESIKELPELLETS
AUS
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX
.
141
4.1
1
D-SDS-PAGE
EINZELNER
SOLUBILISIERUNGSEXTRAKTE
.
141
4.2
2D-SDS-PAGE
EINZELNER
SOLUBILISIERUNGSEXTRAKTE
.
142
4.3
PRAEPARATIVE
1
D-SDS-PAGE
UND
DARAUS
CHARAKTERISIERTE
PROTEINE
.
144
5.
NACHWEIS
DER
PHENOLOXIDASE
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
IM
GEL
.
146
6.
PROTEOMANSATZ
MIT
MUTANTEN
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
.
148
6.1
IDEE
DIESES
PROTEOMVERGLEICHES
.
148
6.2
MUTANTEN
-
SEREN
IM
UEBERBLICK
.
148
6.3
STUDIEN
ZUR
WAHL
DES
PH-BEREICHES
IN
DER
ERSTEN
DIMENSION
.
150
6.4
PROTEOMANALYTISCHER
ANSATZ
ZU
DEN
MUTANTEN
-
SEREN
IM
GESPREITZTEN
PH
GRADIENTEN-BEREICH
VON
PH
4-6
UND
PH
5.5-7.5
.
152
6.4.1
GEWAEHLTES
GELSYSTEM
.
152
6.4.2
ANALYTISCHE
ZWEIDIMENSIONALE
GELE
VON
DEN
MUTANTEN
-
SEREN
.
153
6.4.3
COMPUTERUNTERSTUETZTE
AUSWERTUNG
DER
ZWEIDIMENSIONAL
AUFGETRENNTEN
PROTEINEXPRESSIONSMUSTER
.
154
6.4.3.1
SPOTDETEKTION
UND
SPOTZUORDNUNG
.
154
6.4.3.2
BETRACHTUNG
DER
MUTANTEN
-
SEREN
BEZUEGLICH
DER
QUANTITATIVEN
PROTEINEXPRESSION
.
155
6.4.4
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MUTANTEN
UND
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
WILDTYP:
UNTERSCHIEDE
IM
PROTEINSPOTMUSTER
DER
SEREN
IM
DETAIL
BETRACHTET
.
160
6.4.4.1
BEISPIELE
AUS
DER
QUANTITATIVEN
AUSWERTUNG
.
160
6.4.4.2
UNTERSCHIEDE
IM
BEREICH
DER
MLPS
(MAJOR
LATEX
PROTEINE)
.
167
6.5
CHARAKTERISIERUNG
EINIGER
PROTEINE
.
168
6.5.1
IDENTIFIZIERUNG
UEBER
EDMAN-SEQUENZIERUNG
.
169
6.5.2
IDENTIFIZIERUNG
UEBER
MALDI-MASSEN-YINGERPRZNZ
.
169
7.
PROTEINZUSAMMENSETZUNG
IN
DEN
LATICES
ZWEIER
WEITERER
PAPAVER
-
ARTEN:
PAPAVER
BRACTEATUM
UND
PAPAVER
SETIGERUM
.
171
7.1
PAPAVER
BRACTEATUM'.
PROTEINMUSTER
DES
SERUMS
IM
UEBERBLICK
.
171
7.2
PAPAVER
SETIGERUM
UND
PAPAVER
SOMNIFERUM:
DAS
YYLATEX-PROTEOM
"
ZWEIER
MORPHINPRODUZENTEN
IM
VERGLEICH
.
174
8.
PROTEINZUSAMMENSETZUNG
ANDERER
LATICES
.
176
8.1
1
D-SDS-PAGE
VON
HEVEA
BRASILIENSIS
-
UND
EUPHORBIA
TIRUCALLI
-
LATEX
.
177
8.2
ANALYTISCHE
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
VON
HEVEA
BRASILIENSIS
-
LATEX
.
178
TEIL
D
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ULTRASTRUKTUR
DES
MILCHSAFTES
UND
DER
MILCHROEHREN
MITTELS
ELEKTRONEN
MIKROSKOPIE
_
_
.
_
_
.
_
180
1.
MILCHROEHREN
.
180
2.
STUDIEN
ZUM
ISOLIERTEN
MILCHSAFT
.
183
INHALTSVERZEICHNIS
V
2.1
ULTRASTRUKTUR
DES
ISOLIERTEN
MILCHSAFTES
.
183
2.2
VESIKELFRAKTIONEN
UNTERSCHIEDLICHER
DICHTE
.
184
2.3
VESIKEL
MIT
YYKAPPEN
"
.
186
V.
DISKUSSION
.
189
1.
SEKUNDAERSTOFFE
UND
DEREN
METABOLISMUS
-
DIE
PROTEINAUSSTATTUNG
ALS
METHODISCH-ANALYTISCHER
ANSATZPUNKT
.
189
2.
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
LATEX:
EIN
BLICK
IN
ULTRASTRUKTUR
UND
SEKUNDAERSTOFFMUSTER
.
191
3.
DIE
PROTEINAUSSTATTUNG
IM
PAPAVER
SOWM/ERAW-MILCHSAFT
.
194
3.1
DIE
PROTEINMUSTER
VON
GESAMTLATEX,
SERUM,
GESAMTVESIKELPELLET
UND
VESIKELFRAKTIONEN
.
194
3.2
IDENTIFIZIERTE
PROTEINE
UND
DEREN
MOEGLICHE
FUNKTIONEN
IM
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MILCHSAFT
.
196
3.3
UNTERSUCHUNG
DES
MEMBRANHALTIGEN
ANTEILS
DES
1000
X
G
-
VESIKELPELLETS
.
206
4.
UNTERSUCHUNG
WEITERER
MILCHSAEFTE
.
209
4.1
VERGLEICH
MIT
MILCHSAEFTEN
ANDERER
PAPAVER
-
ARTEN
BZW.
PFLANZENFAMILIEN
.
209
4.2
PROTEOMANALYTISCHER
ANSATZ
MIT
PAPAVER
SOMNIFERUM
-
MUTANTEN
.
210
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
.
214
VII.
ANHANG
.
218
1.
KURZSCHREIBWEISEN
FTLR
DIE
PROTEINOGENEN
AMINOSAEUREN
.
218
2.
STRUKTURFORMELN
DER
VERWENDETEN
REFERENZSUBSTANZEN
.
219
3.
AUSWERTUNG
DES
PROTEOMANALYTISCHEN
ANSATZES
DER
MUTANTEN
-
SEREN
.
220
VHI.
LITERATURVERZEICHNIS
.
229 |
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