Klonierung und Sequenzierung der cDNA des Angiotensin-I-Konvertierungsenzyms der Ratte:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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| Beschreibung: | Freiburg (Breisgau), Univ., Diss., 1996 |
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INHALTSVERZEICHNIS
0. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 1
1. EINLEITUNG 4
1.1. DAS RENIN-ANGIOTENSIN-SYSTEM 4
1.2. LOKALISATION DES ACE 5
1.3. SUBSTRATE DES ACE 5
1.4. MOLEKULARBIOLOGISCHE ASPEKTE DES ACE 6
1.4.1. STRUKTUR DES ACE-PROTEINS 6
1.4.2. DAS GEN DES ACE 7
1.5. KLONIERUNG DER RATTEN ACE CDNA 9
2. MATERIAL 11
2.1. GEBRAEUCHLICHE PUFFER UND LOESUNGEN 11
2.2. MEDIEN UND NAEHRBOEDEN FUER DIE BAKTERIENKULTUR 13
2.2.1. FLUESSIGE MEDIEN 13
2.2.2. NAEHRBOEDEN 13
2.3. BAKTERIENSTAEMME 14
2.4. KLONIERUNGSVEKTOREN 14
2.4.1. PLASMIDE 14
2.4.2. BAKTERIOPHAGEN 14
2.4.3. HELFERPHAGEN 14
2.5. MARKER 14
2.5.1. DNA-MARKER 14
2.5.2. RNA-MARKER 15
2.6. OLIGONUKLEOTIDE 15
2.7. ENZYME 15
2.7.1. POLYMERASEN 15
2.7.2. RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN TYP N 16
2.7.3. EXONUKLEASEN 16
2.7.4. SONSTIGE ENZYME 16
2.8. GEWEBE 17
3. METHODEN 18
3.1. ALLGEMEINE METHODEN 18
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.1.1. STERILISIEREN
3.1.2. AUSFAELLEN UND WASCHEN VON NUKLEINSAEUREN
3.1.3. PHENOL-EXTRAKTION
3.1.4. MINIGEL-ELEKTROPHORESE
3.1.5. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN
3.2. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS GEWEBE
3.3. ANREICHERUNG VON POLY(A)+-RNA
3.4. HERSTELLUNG EINER CDNA-BANK
3.4.1.
SYNTHESE DER
CDNA
3.4.2. LIGATION DES ECO RI / NOT I - ADAPTERS
3.4.3.
INSERTION DER
CDNA
IN DEN X-ZAP-D-PHAGENVEKTOR
3.4.4. VERPACKUNG DER INSERT/PHAGEN-DNA
3.4.5. TITERBESTIMMUNG DER PHAGENBANK
3.5. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN
3.6. HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN DNA-FRAGMENTEN
3.7. SELEKTION BESTIMMTER KLONE AUS EINER CDNA-PHAGENBANK
3.7.1. AUSPLATTIEREN DER PHAGEN
3.7.2. LOKALISATION DER GEWUENSCHTEN PHAGENKLONE
3.7.3. PLAQUEREINIGUNG
3.8. DER X-ZAPH-PHAGENVEKTOR
3
'8'1' BESCHREIBUNG DES X-ZAPII-PHAGENVEKTORS
3.8.2.
IN VIVO
EXZISION DES PBLUESCRIPT-PLASMIDS
3.9. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA
3.10. SPALTUNG
VON
DNA MIT
TYPII-RESTNKUEONSENDONUKLEASEN
3.11. TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN AUF NITROZELLULOSEFFLTER
3.11.1. DNA-TRANSFER (SOUTHEM-BLOT)
3.11.2. RNA-GEL UND RNA-TRANSFER (NORTHEM-BLOT)
3.12. WIEDERGEWINNUNG VON DNA AUS EINEM LMPTIEL ("GELASE- VERDAUUNG
DEPHOSPHORYLIERUNG VON VEKTORENDEN
3.14. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN IN PLASMIDVEKTOREN
3.15. HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN AIR DIE TRANSFORMATION
PLASMID-DNA
I VON
3.16. TRANSFORMATION KOMPETENTER
EXOLI
JM109-BAKTERIEN
3.17. DNA-SEQUENZANALYSE
3.17.1.
DENATURIERUNG DER "TEMPLA1E"-DNA UND HYBRIDISIERUNG MIT
DEM SEQUENZIERUNGSPRIMER ("ANNEALING"-REAKTION)
3.17.2. SEQUENZIERREAKTION
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37
37
3.17.3. HERSTELLUNG DER SEQUENZIERGELE
3.1
7
.
4
.
GELELEKTROPHORESE
3.18. STUFENWEISE VERKUERZUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH
EXONUKLEASE HI-VERDAUUNG
3.19. RNA-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RNA-PCR)
3.19.1. REVERSE TRANSKRIPTION
3.19.2. PCR-AMPLIFIKATION
3.20. SYNTHESE, REINIGUNG UND KONZENTRATIONSBESDMMUNG VON
OLIGONUKLEOTIDEN
3.21. COMPUTERGESTUETZTE ANALYSEN VON CDNA- UND AMINOSAEUREN-SEQUENZ
3.21.1. HYDROPATHIE-ANALYSE
3.21.2. DOT-MATRIX-ANALYSE
38
39
39
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42
42
ERGEBNISSE
4.1. ERSTELLEN EINER CDNA-PHAGENBANK AUS LUNGENGEWEBE DER RATTE
4.1.1. RNA-PRAEPARATION UND POLY(A)+-ANREICHEMNG
4.1.2. CDNA-SYNTHESE
4.1.3. INSERTION DER CDNA IN X-ZAPH-PHAGENVEKTORARME
4.2. SCREENING DER PHAGENBANK NACH ACE-POSITIVEN KLONEN
4.3. SUBKLONIERUNG DER ACE-POSITIVEN PHAGENKLONE DURCH
IN VIVO
EXZISION
DES PBLUESCRIPT PHAGEMIDES
4.4. CHARAKTERISIERUNG DER SUBKLONIERTEN
ACE CDNA
KLONE
4.5. RESTRIKTIONSKARTIERUNG
4.6. DNA-SEQUENZANALYSE NACH DER KETTENABBRUCHMETHODE
4.6.1. PRINZTP DER KETTENABBRUCHMETHODE
4.6.2. VORGEHENSWEISE BEI DER SEQUENZIERUNG ("SEQUENZIERSTRATEGIE")
4.6.3. DIE ACE CDNA-SEQUENZ DER RATTE
4.7. NACHWEIS VERSCHIEDENER ACE MRNA-SPEZIES IM LUNGENGEWEBE DER
RATTE DURCH NORTHERN BLOT-UNTERSUCHUNGEN
4.8. COMPUTERGESTUETZTE ANALYSEN DER RATTEN ACE CDNA- UND
AMINOSAEUREN-SEQUENZ
4.8.1. HYDROPATHIE-ANALYSE DER ACE-AMINOSAEURESEQUENZ DER RATTE
4.8.2. DIE ACE-AMINOSAEURESEQUENZ DER RATTE BESTEHT AUS ZWEI
DOMAENEN MIT HOHER HOMOLOGIE
4.8.3. SEQUENZHOMOLOGIEVERGLEICHE MIT ANDEREN SPEZIES
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5. DISKUSSION
5.1.
DAS ACE-PROTEIN DER RATTE
5.2. VERGLEICH EINZELNER FUNKTIONSBEREICHE DER AMINOSAEURESEQUENZ DES
ACE DER RATTE MIT DENEN ANDERER SPEZIES
5.3. IM LUNGENGEWEBE DER RATTE WERDEN ZWEI VERSCHIEDENE MRNA-SPEZIES
DER ENDOTHELIALEN ISOFORM DES ACE EXPRIMIERT
5.3.1. DER 3'-NICHT-TRANSLATIERTE BEREICH DES ACE DER RATTE
5.3.2. VERGLEICH MIT UNTERSUCHUNGEN BEI ANDEREN SPEZIES
5.3.3. BEDEUTUNG VON 3'NTB UND POLY(A)-SCHWANZ FUER DIE STABILITAET
DERMRNA
5.4. VERGLEICH DER HIER GESTELLTEN SEQUENZ MIT DER ACE CDNA-SEQUENZ
DER RATTE, DIE VOR KURZEM VEROEFFENTLICHT WURDE
6. ZUSAMMENFASSUNG
7. LITERATURVERZEICHNIS |
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