Ubiquitin ist ein Protein von 76 Aminosäuren und kommt in jeder eukaryotischen Zelle vor. Seine Konjugation an Zielproteine spielt in praktisch jedem zellulären Prozess eine wichtige Rolle. Ubc6 aus Saccharomyces cerevisiae ist das einzige Ubiquitin-konjugierende Enzym, das in der Lage ist den C-ter...

Ausführliche Beschreibung

Bibliographische Detailangaben

1. Verfasser:	Ferri Blázquez, Alba (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Elektronisch E-Book
Sprache:	English
Veröffentlicht:	Berlin [2025?]
Schlagworte:	Hochschulschrift
Online-Zugang:	Volltext Volltext
Zusammenfassung:	Ubiquitin ist ein Protein von 76 Aminosäuren und kommt in jeder eukaryotischen Zelle vor. Seine Konjugation an Zielproteine spielt in praktisch jedem zellulären Prozess eine wichtige Rolle. Ubc6 aus Saccharomyces cerevisiae ist das einzige Ubiquitin-konjugierende Enzym, das in der Lage ist den C-terminus von Ubiquitin sowohl über eine Oxyesterbindung mit hydroxylierten Aminosäuren zu verknüpfen, als auch die kanonische Isopeptid Bindung an Lysinen zu erzeugen. Säugetiere exprimieren zwei orthologe Proteine von Ubc6, Ub2J1 und Ub2J2, die sich in Sequenz und Struktur sehr ähneln. Die Oxyester-Ubiquitinierung wurde auch für Ub2J2 nachgewiesen. Die vorliegende Arbeit identifizierte zwei Positionen innerhalb von Ubc6, die seine Fähigkeit beeinflussen, Serin- und Threoninreste zu modifizieren, Histidin 94 und Threonin 121. Ubc6-Varianten mit Substitutionen an einer oder beiden Positionen wurden erzeugt und ihre enzymatische Aktivität in vitro bestimmt. Die Eigenschaften dieser Varianten wurden auch in vivo bestätigt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Oxyesteraktivität für die ordnungsgemäße Funktion bei ER-assoziierter Proteolyse entscheidend ist. Die zellulären Auswirkungen genomischer Deletionen der orthologen Gene in HeLa- und HEK293T-Zellen wurden mittels Massenspektrometrie untersucht. Bisher unbekannte potenzielle Substrate der Orthologen Enzyme konnten identifiziert werden, und die Analyse der knock-out Mutanten ergab das UBE2J1 und UBE2J2 wichtig für das Überleben der Zellen und die ordnungsgemäße ER-Funktion sind, vermutlich durch Veränderungen im Unfolded Protein Response. Schließlich versuchten wir, Proteine mit Oxyester-gebundener Ubiquitinierung im Proteom menschlicher und Hefezellen zu identifizieren. [...] Englische Version: Ubiquitin, present in every eukaryotic cell, plays a role in virtually every cellular process. Ubc6 is the only E2 enzyme capable of attaching Ubiquitin to hydroxylated amino acids via an oxyester bond, as well as generating the canonical isopeptide-linked lysine modification, in Saccharomyces cerevisiae. Mammals express two ortholog proteins of Ubc6, Ub2J1 and Ub2J2, very similar in sequence and structure. Oxyester ubiquitylation has also been demonstrated for Ub2J2. However, the mechanisms by which this modification is generated, and what positions in the enzymes are responsible for this activity are unknown. The present work identified two positions within Ubc6 that influence its ability to target serine and threonine residues: histidine 94 and threonine 121. Variants with substitutions in either or both positions were generated, and their enzymatical activity was studied in vitro. The ability of these variants to complement the absence of WT Ubc6 was also assayed in vivo. Our results suggest that oxyester activity is crucial for the proper function of Ubc6 in ER-Associated Degradation. The cellular effects resulting from genomic deletions of the J1 and J2 genes in HeLa and HEK293T cells were examined through mass spectrometry analysis. We discovered that the functions of these two very similar proteins do not overlap, but seem to counteract each other, identified previously unknown potential substrates of each, and found aberrations caused by their absence in a pathway crucial for survival and proper ER function, the Unfolded Protein Response. Lastly, we attempted to identify proteins carrying oxyester-linked ubiquitylation in the proteome of human and yeast cells. Despite its definitive existence in cells, it is crucial to establish specific strategies that target these non-canonical modifications in high-throughput studies.
Beschreibung:	Tag der mündlichen Prüfung: 10.02.2025 Der Text enthält eine Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache. Veröffentlichung der elektronischen Ressource auf dem edoc-Server der Humboldt-Universität zu Berlin: 2025
Beschreibung:	1 Online-Ressource (X, 135 Seiten) Illustrationen, Diagramme
DOI:	10.18452/32886