Generierung pulmonaler Progenitorzellen aus murinen embryonalen Stammzellen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Freiburg im Breisgau
[2023]
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
V
TABELLENVERZEICHNIS
VII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
IX
1
EINLEITUNG
1
1.1
ENTWICKLUNG
DER
LUNGE
IN
DER
MAUS
1
1.1.1
ENTWICKLUNG
DES
MAUSEMBRYOS
BIS
ZUR
GASTRULATION
1
1.1.2
ENTWICKLUNG
DES
DEFINITIVEN
ENDODERMS
2
1.1.3
ENTWICKLUNG
DES
ANTERIOREN
VORDERDARMENDODERMS
3
1.1.4
BILDUNG
DER
LUNGENKNOSPE
5
1.1.5
SIGNALWEGE
WAEHREND
DER
LUNGENENTWICKLUNG
7
1.1.6
VERGLEICH
ETABLIERTER PROTOKOLLE
ZUR
DIFFERENZIERUNG
VON
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
INVITRO
11
1.2
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
P63
14
1.2.1
P63
ALS
MARKER
MULTIPOTENTER
PROGENITORZELLEN
IN
EPITHELIEN
14
1.2.2
CHARAKTERISTIKA
VON
P63
15
1.2.3
FUNKTIONEN
VON
P63
16
1.2.4
KLINISCHES
BILD
VON
PATIENTEN
MIT
P63-MUTATIONEN
17
1.3
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
NKX2.1
17
1.3.1
FUNKTIONEN
VON
NKX2.1
17
1.3.2
CHARAKTERISTIKA
VON
NKX2.1
18
1.3.3
PHAENOTYP
NKX2.1-DEPLETIERTER
MAEUSE
19
1.3.4
KLINISCHES
BILD
VON
PATIENTEN
MIT
NKX2./-MUTATIONEN
19
1.4
SONSTIGE
MARKER
19
1.4.1
SOX17
20
1.4.2
FOXA2
20
1.4.3
SOX2
21
1.5
ZIELE
DER
ARBEIT
22
2
MATERIAL
UND
METHODEN
23
2.1
MATERIALIEN
23
2.1.1
CHEMIKALIEN
23
2.1.2
ANTIKOERPER
25
2.1.3
ENZYME
26
2.1.4
ENZYMPUFFER
26
2.1.5
PUFFER
UND
LOESUNGEN
27
2.1.6
ZELLKULTURMEDIA
27
2.1.7
PLASMIDE
28
2.1.8
PRIMER
28
2.1.9
TRANSCRIPTION-ACTIVATOR
LIKE
ENDONUCLEASES
(TALENS)
29
2.1.10
GUIDE
RNA
FUER
CRISPR/CAS-KONSTRUKTE
29
2.1.11
ZELLLINIEN
30
2.1.12
KITS
30
2.1.13
GERAETE
UND
SOFTWARE
30
2.2
ZELLKULTUR
31
2.2.1
BESCHICHTUNG
VON
ZELLKULTURSCHALEN
31
2.2.2
KULTIVIERUNG,
PASSAGIERUNG
UND
INAKTIVIERUNG
VON
FUETTERZELLEN
31
2.2.3
KULTIVIERUNG
VON
IMCD3-ZELLEN
32
2.2.4
KULTIVIERUNG
VON
STAMMZELLEN
32
2.2.5
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
33
2.2.6
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
33
2.2.7
LYSE
VON
ZELLEN
34
2.2.8
ANFERTIGUNG
VON
EMBRYOID
BODIES
34
2.2.9
DIFFERENZIERUNG
VON
STAMMZELLEN
ZU
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
MITHILFE
EINES
PROTOKOLLS
FUER
MURINE
EMBRYONALE
STAMMZELLEN
35
2.2.10
DIFFERENZIERUNG
VON
STAMMZELLEN
ZU
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
MITHILFE
EINES
PROTOKOLLS
FUER
HUMANE
INDUZIERTE
PLURIPOTENTE
STAMMZELLEN
37
2.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
VERFAHREN
39
2.3.1
STANDARD
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
UND
DNA-AUFREINIGUNG
39
2.3.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
UND
DNA-EXTRAKTION
AUS
DEM
GEL
39
2.3.3
MESSUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
40
2.3.4
DNA-VERDAU
DURCH
RESTRIKTIONSENZYME
40
2.3.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
40
2.3.6
LIGATION
40
2.3.7
TRANSFORMATION
40
2.3.8
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI-BAKTERIEN
41
2.3.9
PRAEZIPITATION
DER
DNA
MITTELS
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
41
2.4
GENERIERUNG
GENETISCH
VERAENDERTER
KNOCK-IN-ZELLEN
41
II
2.4.1
GOLDEN
GATE
KLONIERUNG
DER
TALENS
42
2.4.2
KLONIERUNG
VON
GRNA-KONSTRUKTEN
43
2.4.3
TRANSFEKTION
VON
IMCD3-ZELLEN
44
2.4.4
TRANSFEKTION
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
44
2.4.5
SELEKTION
UND
PICKEN
VON
KLONEN
45
2.4.6
LYSE
UND
SCREENING
DER
ZELLKLONE
45
2.4.7
ETHANOL-PRAEZIPITATION
DER
DNA
DER
KLONE
46
2.5
HISTOLOGIE
46
2.5.1
KRYO-EINBETTUNG
FUER
GEFRIERSCHNITTE
46
2.5.2
IMMUNFLUORESZENZFARBUNG
VON
ZELLEN
46
2.6
GENERIERUNG
EINER
KNOCK-IN-MAUSLINIE
47
2.6.1
GENERIERUNG VON
KNOCK-IN-MAEUSEN
47
2.6.2
DISSEKTION
47
2.6.3
GENOTYPISIERUNG
48
3
ERGEBNISSE
49
3.1
TARGETING-STRATEGIE
ZUR
GENERIERUNG
DES
ANTRP63
GFP
BAD-ALLELS
49
3.1.1
KLONIERUNG
VON
TALENS
UND
CRISPR/CAS
50
3.1.2
KLONIERUNG
DES
TARGETING-VEKTORS
51
3.1.3
ANALYSE
POTENTIELL
ERFOLGREICH
GEZIELT
GENMODIFIZIERTER
ZELLKLONE
52
3.2
DIFFERENZIERUNG
VON
A21OX-ZELLEN
MIT
ANTRP63GFPBSA-ALLEL
ZU
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
54
3.2.1
COATING
DER
ZELLKULTURSCHULE
BEI
DER
DIFFERENZIERUNG
55
3.2.2
DIFFERENZIERUNG
VON
A21OX-ZELLEN
ZU
NKX2.1
-POSITIVEN,
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
56
3.2.3
ANALYSE
DER
FUNKTIONALITAET
DES
4NTRP63GFP
BSD-ALLELS
57
3.2.4
HETEROGENITAET
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG ZU
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
59
3.2.5
DIFFERENZIERUNG
ZU
ANTERIOREM
ENDODERM
UEBER
EMBRYOID
BODIES
61
3.2.6
EINFLUSS
DER
KONZENTRATION
DES
TGFSS
UND
DES
WNT-ANTAGONISTEN
AUF
ZELLDICHTE
UND
FOXA2-/SOX2-EXPRESSION
64
3.2.7
VERGLEICH
DER
EFFEKTIVITAET
DER
DIFFERENZIERUNG
BEI
CCE
UND
A21OX-ESC
65
3.2.8 A21OX-ZELLEN
LASSEN
SICH
DURCH
DAS
DIFFERENZIERUNGSPROTOKOLL
IN
ENDODERM
DIFFERENZIEREN
ODER
BLEIBEN
IM
STAMMZELLZUSTAND
66
3.3
GENERIERUNG
EINES
NKX2.1"CHERV-FLUORESZENZREPORTER-ALLELS
67
3.3.1
KLONIERUNG
DER
TALENS
68
3.3.2
KLONIERUNG
DES
TARGETING-VEKTORS
69
III
3.3.3
ANALYSE
POTENTIELL
ERFOLGREICH
GEZIELT
GENMODIFIZIERTER
ZELLKLONE
70
3.4
GENERIERUNG
EINER
4NTRP63GFP
BSD-KNOCK-IN-MAUSLINIE
72
3.4.1
GENOTYPISIERUNG
DER
4NTRP63GFP
BS-KNOCK-IN-MAEUSE
72
3.4.2
PHAENOTYP
DER
4NTRP63CGFPBS/-KNOCK-IN-MAEUSE
73
4
DISKUSSION
75
4.1
DIFFERENZIERUNG
VON
MESC
ZU
PULMONALEN
PROGENITORZELLEN
75
4.1.1
ZEITLICHE
KOMPONENTE
DER
GABE
DER
WACHSTUMSFAKTOREN
76
4.1.2
KONZENTRATION
DER
WACHSTUMSFAKTOREN
77
4.1.3
PASSAGIERUNG
DER
ZELLEN
UND
ZELLDICHTE
77
4.1.4
PASSAGE
DER
ZELLEN
UND
ZELLTYP
77
4.1.5
WACHSTUM
ALS
MONOLAYER
ODER
EMBRYOID
BODY
78
4.1.6
COATING
DER
ZELLKULTURSCHALEN
UND
FUETTERZELLEN
79
4.1.7
WEITERE
OPTIMIERUNGSMOEGLICHKEITEN
ZUR
GENERIERUNG
RESPIRATORISCHER
VORLAEUFERZELLEN
79
4.2
GENERIERUNG
DES
4NTRP63GFPBAD-ALLELS
79
4.3
GENERIERUNG
DES
NKX2.
IMCHERR-ALLELS
80
4.4
GENERIERUNG
DER
4NTRP63GFPBSD-KNOCK-IN-MAUSLINIE
81
4.5
EINORDNUNG
IN
DIE
AKTUELLE
LITERATUR
81
ZUSAMMENFASSUNG
83
LITERATURVERZEICHNIS
84
LEBENSLAUF
XIII
EIDESSTATTLICHE
VERSICHERUNG
XIV
ERKLAERUNG
ZUM
EIGENANTEIL
XV
DANKSAGUNG
XVI
IV |
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