Bioinformatische und biochemische Untersuchungen von Homologen zur humanen Glucocerebrosidase in dem Modellorganismus Caenorhabditis elegans:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Münster
2023
|
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| Beschreibung: | 226, XVII Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
LYSOSOMEN
.
1
1.1.1
DIE
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
VON
LYSOSOMEN
.
1
1.1.2
CHARAKTERISTIKA
VON
LYSOSOMEN
UND
LYSOSOME-RELATED
ORGANELLES
.
2
1.1.3
LYSOSOMALE
HYDROLASEN
.
3
1.2
DIE
HUMANE
.
4
1.2.1
DIE
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER HUMANEN
GLUCOCEREBROSIDASE
.
4
1.2.2
SYNTHESE
UND
TRANSPORT DER
GCASE
.
5
1.2.3
ENZYMATISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
GCASE
.
7
1.2.4
DIE
STRUKTUR
DER
GCASE
.
11
1.2.5
PATHOPHYSIOLOGIE
DER
GCASE.
14
1.3
DER
MODELLORGANISMUS
CAENORHABDITIS
ELEGANS
.
15
1.3.1
ETABLIERUNG
VON
C.
ELEGANS
ALS
MODELLORGANIMUS
.
16
1.3.2
ANATOMIE
UND
LEBENSZYKLUS
VON
C.
ELEGANS
.
16
1.3.3
DAS
ENDO-LYSOSOMALE
KOMPARTIMENT
VON
C.
ELEGANS
.
19
1.3.4
SPHINGOLIPIDE
IN
C.
ELEGANS.
20
1.4
ZIELSETZUNG
.
21
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
23
2.1
MATERIALIEN
.
23
2.1.1
GERAETE
.
23
2.1.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
25
2.2
CHEMIKALIEN
.
26
2.3
ENZYME,
NUKLEOTIDE
UND
DNA-STANDARD
.
28
2.4
PROTEINE,
PROTEASEINHIBITOREN
UND
PROTEINSTANDARDS
.
29
2.5
LOESUNGEN
UND
KITS
ZUR
BEARBEITUNG
VON
DNA,
RNA
UND
PROTEINEN
.
29
2.6
ANTIKOERPER
.
30
2.6.1
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.
30
2.6.2
SEKUNDAERANTIKOERPER
UND
FLUORESZENZFARBSTOFFE
.
31
2.7
VERWENDETE
KOMMERZIELLE
VEKTOREN
.
31
2.8
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
31
2.9
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
34
2.10
ZELLKULTURMEDIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
ARBEITEN
MIT
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
.
35
2.11
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
.
35
2.12
ORGANISMEN.
36
2.12.1
BAKTERIENSTAEMME
.
36
2.12.2
EUKARYOTISCHE
ZELLLINIEN
.
38
2.12.3
C.
.
38
2.13
BIOINFORMATISCHE
METHODEN
.
39
2.13.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
HOMOLOGEN ZUR
GCASE
IN
C.
ELEGANS
UND
ERMITTLUNG
DER
SIGNALPEPTIDSEQUENZEN
.
39
2.13.2
SEQUENZHOMOLOGIE-VERGLEICH
UND
HOMOLOGIE-MODELLIERUNG
DER
PROTEINE
CE-GBA
1-4
.
39
2.14
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
40
2.14.1
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
40
2.14.2
ANLEGEN
VON
GLYCERINKULTUREN
.
40
2.15
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
40
2.15.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
40
2.15.2
EXTRAKTION
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
41
2.15.3
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
41
2.15.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
41
2.15.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
42
2.15.6
LIGATION
VON
PCR-PRODUKTEN
IN
T
OPOISOMERASE-AKTI
VIERTE
V
EKTOREN
.
42
2.15.7
.
43
2.15.8
SEQUENZIERUNG
VON
DNA-SEQUENZEN
.
43
2.15.9
RESTRIKTION
UND
MODIFIKATION
VON
DNA
.
44
2.15.10 LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
.
44
2.15.11
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
.
44
2.15.12
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
KOMPETENTE
BAKTERIENZELLEN
.
44
2.15.13
ARBEITEN
MIT
RNA
.
45
2.15.14
SOUTHERN
BLOT
.
52
2.15.15
KLONIERUNG
VON
EXPRESSIONSVEKTOREN
FUER
DIE
EXPRESSION
VON
CE-GBA-1-4
IN
HEK293-ZELLEN
.
53
2.15.16
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
ZUR
SUBSTITION
Q23
IE
IN
CE-GBA
1
UND
F209I
IN
CE-GBA-2
.
54
2.16
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
55
2.16.1
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
.
55
2.16.2
ENZYMASSAYS
MIT
EUKARYOTEN-ZELLEN
.
56
2.16.3
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
58
2.16.4
ANFAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
.
60
2.16.5
IMMUNOBLOTTING
.
60
2.16.6
IMMUNODETEKTION
MIT
DEN
ANTIKOERPERN
ANTI-CE-GBA
1
-IB,
ANTI-CE-GBA-1-F*,
ANTI-HIS-CE-GBA-1,
ANTI-HIS-CE-GBA-4
UND
ANTI-GST-LMP-1
.
61
2.16.7
IMMUNODETEKTION
DER GAPDH
IM WESTERN
BLOT
.
62
2.16.8
IMMUNODETEKTION
MIT
DEM
ANTI-HIS*ZUG-MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
63
2.17
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
63
2.17.1
KULTIVIERUNG
UND
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
.
64
2.17.2
KRYOKONSERVIERUNG
UND
REVITALISIERUNG
VON
ZELLLINIEN
.
64
2.17.3
TRANSFEKTION
VON
ZELLLINIEN
.
64
2.18
SUBZELLULAERE
FRAKTIONIERUNG
VON
HEK293-ZELLEN
MITTELS
PERCOLL-GRADIENTEN
.
65
2.18.1
PRAEPARATION
DER
PROBEN
UND
FRAKTIONIERUNG
.
65
2.18.2
BESTIMMUNG
DER
LATENZ
.
68
2.18.3
MEMBRANISOLIERUNG
AUS
PERCOLL-FRAKTIONEN
.
68
2.18.4
WESTERN
BLOT
MIT
ISOLIERTEN
MEMBRANEN
DER
PERCOLL-FRAKTIONEN
.
69
2.19
ARBEITEN
MIT
C.
ELEGANSS
.
69
2.19.1
KULTIVIERUNG
VON
C.
ELEGANS
.
69
2.19.2
HERSTELLUNG
VON
NEMATODE
GROWTH
MEDIUM
(NGM)-PLATTEN
.
69
2.19.3
ERNTE
UND
WASCHEN
VON
WUERMERN
.
70
2.19.4
DEKONTAMINATION
(BLEACHING')
VON
PLATTEN
.
70
2.19.5
SYNCHRONISATION
VON
WURMSTADIEN
.
71
2.19.6
SUCROSE
FLOTATION
ZUR
DEKONTAMINATION
LEBENDIGER
WUERMER
.
71
2.19.7
HERSTELLUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
C.
ELEGANS
FUER
IMMUNOBLOTTING
.
72
2.19.8
IMMUNHISTOCHEMIE
MIT
C.
ELEGANSS
.
72
2.19.9
KERNFAERBUNG
IN
C.
ELEGANS
MIT
DEM
FLUORESZENZFARBSTOFF
HOECHST
33258
.
75
2.19.10
MIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
GFP-FLUORESZENZ
TRANSGENER
WUERMER
IN
VIVO
.
76
2.20
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
CE-GBA-1,
-3
UND
-4
SOWIE
LMP-1
.
76
2.20.1
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
CE-GBA-1
MIT
DEM
PMAL
PROTEIN
FUSION
AND
PURIFICATION
SYSTEM
.
77
2.20.2
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
CE-GBA-1,
CE-GBA-3
UND
CE-GBA-4
MIT
.
83
2.20.3
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
LYSOSOMALE
PROTEIN
LMP-1
MIT
DEM
GST
GENE
FUSION
SYSTEMS
.
87
2.20.4
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
UND
GEWINNUNG
DER
ANTISEREN
.
89
2.20.5
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
UND
GEWINNUNG
DER
ANTISEREN
.
90
2.20.6
ENTFERNEN
UNSPEZIFISCHER,
GEGEN
BAKTERIELLE
PROTEINE
GERICHTETER ANTIKOERPER
AUS
POLYKLONALEN
ANTISEREN
.
90
2.20.7
DIE
BESTIMMUNG
DES
ANTIKOERPERTITERS
VON
ANTI-CE-GBA
1-F*
.
91
2.21
ERSTELLEN
VON
PLASMIDKARTEN
.
91
3
ERGEBNISSE
.
92
3.1
IDENTIFIZIERUNG,
KLONIERUNG
UND
EXPRESSIONSNACHWEIS
VON
HOMOLOGEN
ZUR
HUMANEN
GLUCOCEREBROSIDASE
IN
C.
ELEGANS
.
92
3.1.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
VIER
HOMOLOGEN
GENEN:
GBA-1,
GBA-2,
GBA-3
UND
GBA-4
.
92
3.1.2
KLONIERUNG
UND
VERIFIZIERUNG DER VORHERGESAGTEN
CDNA-SEQUENZEN
.
94
3.1.3
NACHWEIS
DER EXPRESSION
DER HOMOLOGE
CE-GBA-1-4
IN
C.
ELEGANS.
94
3.1.4
ZUSAMMENFASSUNG
.
96
3.2
BIOINFORMATISCHE ANALYSE
DER
HOMOLOGE
.
97
3.2.1
AMINOSAEURESEQUENZVERGLEICH
VON
GCASE
UND
CE-GBA
1-4
.
97
3.2.2
STRUKTURANALYSE
VON
3D-PROTEINMODELLEN
VON
CE-GBA-1-4
.
102
3.2.3
ZUSAMMENFASSUNG
.
108
3.3
FUNKTIONALITAET
DER
C.
ELEGANS-PROTEINE
CE-GBA-1
-4
IN
SAEUGERZELLEN
.
109
3.3.1
GLUCOSYLCERAMIDASE-AKTIVITAET
VON
CE-GBA
1-4
IN
HEK293-ZELLEN
.
109
3.3.2
BEDEUTUNG
DER AMINOSAEUREN
Q23
1
BZW.
1209
FUER
DIE
FUNKTIONALITAET
VON
CE-GBA-1
BZW.
CE-GBA-2
.
112
3.3.3
WIRKUNG
DES
INHIBITORS
CONDURITOL B-EPOXID
AUF
DIE
GLUCOSYLCERAMIDASE-AKTIVITAET
.
113
3.3.4
PH-OPTIMA
DER
PROTEINE
CE-GBA-1-4
.
114
3.3.5
DER
EINFLUSS
VON
TAUROCHOLAT
UND
TRITON
X
100
AUF
DIE
ENZYMAKTIVITAET
VON
CE-GBA-3
UND
CE-GBA-4
.
117
3.3.6
ZUSAMMENFASSUNG
.
118
3.4
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
DER
C.
ELEGANS-HOMOLOGE
IN
SAEUGERZELLEN
.
119
3.4.1
UNTERSUCHUNG
DER
SUBZELLULAEREN LOKALISATION
VON
CE-GBA
1,
CE-GBA-3
UND
CE-GBA-4
IN
HEK293-ZELLEN
MITTELS
PERCOLL-GRADIENT
.
120
3.4.2
ZUSAMMENFASSUNG
.
127
3.5
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
CE-GBA-1,
CE-GBA-3,
CE-GBA-4
UND
LMP-1
.
127
3.5.1
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
POLYKLONALER,
GEGEN
MBP-CE-GBA-1-FUSIONSPROTEINE
GERICHTETER ANTIKOERPER
AUS
KANINCHEN
.
130
3.5.2
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
CE-GBA-1,
-3
UND
-4
IN
MAEUSEN
.
140
3.5.3
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
DEN
LYSOSOMALEN MARKER
LMP-1
IN
KANINCHEN
.
150
3.5.4
ZUSAMMENFASSUNG
.
152
3.6
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
IN
C.
ELEGANS
.
153
3.6.1
IMMUNHISTOCHEMISCHER
NACHWEIS
VON
CE-GBA-1
IN
C.
ELEGANS
MIT
ANTI-CE-GBA
1-IB
UND
ANTI-CE-GBA-1-F*
.
154
3.6.2
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG
IN
C.
ELEGANS
MIT
ANTI-HIS-CE-GBA-1
.
158
3.6.3
NACHWEIS
DES
LYSOSOMALEN
MARKERS
LMP-1
IN
C.
ELEGANS
.
160
3.6.4
ZUSAMMENFASSUNG
.
165
4
DISKUSSION
.
166
4.1
STRUKTURELLE
MERKMALE
VON
CE-GBA-1
-
4
.
166
4.1.1
KLASSIFIZIERUNG
VON
CE-GBA
1
-
4
ALS
PROTEINE
DER
FAMILIE
GH30,
GRUPPE
1.
166
4.1.2
STRUKTUR
UND
SEQUENZVERGLEICH
VON
GCASE
UND
CE-GBA
1-4
.
168
4.2
KATALYTISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
CE-GBA-1-4
.
170
4.2.1
GLUCOSYLCERAMIDASE-AKTIVITAET
VON
CE-GBA
1-4
.
170
4.2.2 PH-OPTIMA
VON
CE-GBA
.
171
4.2.3
EINFLUSS
VON
TAUROCHOLAT
UND
TRITON
X
100
AUF
DIE
ENZYMAKTIVITAET
VON
CE-GBA-3
.
174
4.3
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
UND
TRANSPORT
VON
CE-GBA-1,
-3
UND
-4
IN
HEK293-ZELLEN
.
175
4.4
LOKALISATION
UND
TRANSPORT
VON
CE-GBA-1,
-3
UND
-4
IN
C.
ELEGANS
.
176
4.5
(FUNKTIONALE)
VERWANDTSCHAFT
VON
CE-GBA-1-4
UND
DER
STATUS
ALS
ORTHOLOG
.
178
4.6
C.
ELEGANS
ALS
TIERMODELL
FUER
EINEN
GCASE-MANGEL
.
184
4.7
DISKUSSION
DER
METHODEN
.
186
4.7.1
EXPRESSION
VON
CE-GBA
1-4
IN
HEK293-ZELLEN
UND
ENZYMAKTIVITAETSTESTS
.
186
4.7.2
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
UND
TRANSPORT
VON
CE-GBA-1,
-3
UND
-4
IN
HEK293-ZELLEN
.
187
4.7.3
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
CE-GBA-1-4
UND
LMP-1
.
189
4.8
FAZIT
UND
AUSBLICK
.
192
5
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
195
6
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
199
7
TABELLENVERZEICHNIS
.
202
8
LITERATURVERZEICHNIS
.
203
9
ANHANG
.
I
9.1
CODIERENDE
SEQUENZEN
VON
CE-GBA-1-4
.
1
9.1.1
CODIERENDE
SEQUENZ
VON
CE-GBA-1
.
I
9.1.2
CODIERENDE
SEQUENZ
VON
CE-GBA-2
.
II
9.1.3
CODIERENDE
SEQUENZ
VON
CE-GBA-3
.
III
9.1.4
CODIERENDE
SEQUENZ
VON
CE-GBA-4
.
IV
9.2
PLASMIDKARTEN
.
IV
9.3
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZEN:
PRAEIMMUNSEREN
.
XV |
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Inhaltsverzeichnis