Modulation der Immunogenität mesenchymaler Stammzellen durch den CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout der MHC-Komplexe:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Freiburg im Breisgau
[2021]
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | IX, 105 Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm |
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Datensatz im Suchindex
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.............................................................................................
VIII
1.
EINLEITUNG
.................................................................................................................
10
1.1
POTENTIAL
MESENCHYMALER
STAMMZELLEN
.........................................................
10
1.2
TRANSPLANTATABSTOSSUNG
..................................................................................
14
1.3
MAJOR
HISTOCOMPATIBILITY
COMPLEX
I
UND
II
......................................................
17
1.4
DAS
CRISPR/CAS9-SYSTEM
...........................................................................
18
ZIELSETZUNG
DIESER
ARBEIT
..........................................................................................
21
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
...........................................................................................
22
2.1
ZELLKULTUR
............................................................................................................
26
2.1.1
ZELLKULTURMEDIUM
UND
KULTURBEDINGUNGEN
.................................................
26
2.1.2
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
..............................................................................
26
2.1.3
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
............................................................
26
2.2
VERGLEICH
DER
EIGENSCHAFTEN
VON
IMSCS,
N-MSCS
UND
AMSCS
.......................
27
2.2.1
FACS-ANALYSE
DER
OBERFLAECHENMARKER
.....................................................
27
2.2.2
OSTEOGENE
DIFFERENZIERUNG
.........................................................................
28
2.2.3
MHC-EXPRESSION
NACH
OSTEOGENER
DIFFERENZIERUNG
....................................
29
2.2.4
CHONDROGENE
DIFFERENZIERUNG
....................................................................
29
2.2.4
ADIPOGENE
DIFFERENZIERUNG
.........................................................................
31
2.2.6
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
...........................................................................
32
2.2.7
BESTIMMUNG
DER
KLONIERUNGSEFFIZIENZ
MITTELS
EINES
EINZELLDRUCKERS
IN
ABWESENHEIT
BZW.
IN
ANWESENHEIT
VOM
ROCK-INHIBITOR
....................................
32
2.3
CRISPR/CAS9
VERMITTELTER
KNOCKOUT
VON
CI
ITA
UND
SS2M
................................
34
2.3.1
HERSTELLUNG
VON
AGARPLATTEN
.......................................................................
34
2.3.2
TRANSFORMATION
DER
PLASMIDE
IN
ESCHERICHIA
COLI
DH10
............................
34
2.3.3
HERSTELLUNG
EINER
UEBERNACHTKULTUR
VON
BAKTERIEN
......................................
34
IV
2.3.4
VERVIELFAELTIGUNG
DER
PLASMIDE
.....................................................................
35
2.3.5
VERIFIKATION
DER
PLASMIDE
............................................................................
36
2.3.6
TRANSFEKTION
DER
IMSCS
MIT
SS2M-,
CIITA
UND
KONTROLLPLASMIDEN
...........
37
2.3.7
FACS-ANALYSE
DER
KOLONIEN
MIT
ANTIKOERPER
GEGEN
MHC-I,
SS2M
UND
MHC-II
IN
ANWESENHEIT
VON
INTERFERON
GAMMA
................................................................
38
2.4
IN
VITRO
CHARAKTERISIERUNG
DER
KNOCKOUT
ZELLLINIEN
............................................
39
2.4.1
LIVE
DEAD
ASSAY
.........................................................................................
39
2.4.2
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
...........................................................................
39
2.4.3
MSC-OBERFLAECHENMARKEREXPRESSION
..........................................................
39
2.4.4
NACHWEIS
DES
CIITA-KO
MIT
DEM
ALT-R
GENOME
EDITING
DETECTION
KIT....
40
2.5
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
............................................................
42
2.5.1
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
MIT
DER
MIXED
LYMPHOCYTE
REACTION
...............................................................................................................
42
2.6
STATISTISCHE
ANALYSE
.........................................................................................
44
3.
ERGEBNISSE
...............................................................................................................
45
3.1
.
CHARAKTERISIERUNG
VON
VERSCHIEDENEN
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
....
45
3.1.1
FACS-ANALYSE
DER
OBERFLAECHENMARKER
.....................................................
45
3.1.2
OSTEOGENE
UND
CHONDROGENE
DIFFERENZIERUNG
..........................................
48
3.1.3
MHC-EXPRESSION
NACH
OSTEOGENER
DIFFERENZIERUNG
BEI
IMSCS
.................
50
3.1.4
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
...........................................................................
51
3.1.5
BESTIMMUNG
DER
KLONIERUNGSEFFIZIENZ
VON
IMSC,
N-MSC
UND
AMSC
IN
ABWESENHEIT
BZW.
IN
ANWESENHEIT
DES
ROCK-INHIBITORS....................................
52
3.2
CRISPR/CAS-9
VERMITTELTER
KNOCKOUT
VON
CIITA
UND
SS2M
...............................
53
3.2.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VOM
SS2M-,
CIITA
UND
SCRAMBLED
PLASMID
MIT
UND
OHNE
KPNI-RESTRIKTIONSVERDAU
......................................................................
53
3.2.2
TRANSFEKTION
DER
IMSCS
MIT
SS2M-,
CIITA
UND
KONTROLLPLASMIDEN
...........
54
3.3
IN
VITRO
CHARAKTERISIERUNG
DER
KNOCKOUT
ZELLLINIEN
............................................
58
3.3.1
MSC-OBERFLAECHENMARKEREXPRESSION
..........................................................
58
3.3.2
OSTEOGENE,
CHONDROGENE
UND
ADIPOGENE
DIFFERENZIERUNG
........................
61
3.3.3
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
VON
SS2M-,
CIITA
UND
KOMBINIERTER
32M/CIITA
KNOCKOUT
KOLONIEN
..............................................................................................
63
3.3.4
LIVE
DEAD
ASSAY
.........................................................................................
64
3.3.5
NACHWEIS
DES
CIITA-KO
MIT
DEM
ALT-R
GENOME
EDITING
DETECTION
KIT....
65
3.4
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
............................................................
67
3.4.1
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
MIT
DER
MIXED
LYMPHOCYTE
REACTION
...............................................................................................................
67
4.
DISKUSSION
...............................................................................................................
68
4.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
BESTEN
ISOLATIONSQUELLE
VON
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
68
4.1.1
MHC-EXPRESSION
NACH
OSTEOGENER
DIFFERENZIERUNG
...................................
71
4.2
DER
MHC-KNOCKOUT
VON
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
...................................
73
4.2.1
EFFEKT
DES
BIALLELEN
KNOCKOUTS
VON
CIITA
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
MHC-II
(HLA-DR)
IN
IMMORTALISIERTEN
MESENCHYMALEN
STAMMZELLENS
...........................
73
4.2.2
EFFEKT
DES
BIALLELEN
KNOCKOUTS
VON
SS-2-MIKROGLOBULINS
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
MHC-I
(HLA-A/-B/-C)
IN
IMMORTALISIERTEN
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
...
74
4.2.3
WELCHE
EFFEKTE
HAT
DER
INDIVIDUELLE
BZW.
KOMBINIERTE
KNOCKOUT
VON
MHC-I
UND
MHC-II
AUF
RELEVANTE
ZELLPARAMETER
WIE
VITALITAET,
PROLIFERATION
UND
BIOMARKEREXPRESSION?
........................................................................................
76
4.3 IMMUNOGENITAET
VON
KNOCKOUT-MSCS
...............................................................
78
4.3.1
WELCHE
EFFEKTE
HAT
DER
INDIVIDUELLE
BZW.
KOMBINIERTE
KNOCKOUT
VON
MHC-I
UND
MHC-II
AUF
DIE
IMMUNOGENITAET
DER
MSCS
IN
VITRO
UND
LASSEN
SICH
HIER
UNTERSCHIEDE
IN
DER
POTENZ
DER
BEIDEN
MHC-TYPEN
IN
BEZUG
AUF
DIE
VERMITTLUNG
DER
IMMUNOGENITAET
NACHWEISEN?
.........................................................................
78
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.................................................................................................
83
6.
AUSBLICK
...................................................................................................................
84
7.
LITERATURVERZEICHNIS
................................................................................................
85
VI
8.
PUBLIKATION
.............................................................................................................
100
9.
LEBENSLAUF
.............................................................................................................
101
10.
EIDESSTATTLICHE
VERSICHERUNG
..............................................................................
102
11.
ERKLAERUNG
ZUM
EIGENANTEIL
..................................................................................
104
12.
DANKSAGUNG
........................................................................................................
105
VII
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VIII
1.
EINLEITUNG
.
10
1.1
POTENTIAL
MESENCHYMALER
STAMMZELLEN
.
10
1.2
TRANSPLANTATABSTOSSUNG
.
14
1.3
MAJOR
HISTOCOMPATIBILITY
COMPLEX
I
UND
II
.
17
1.4
DAS
CRISPR/CAS9-SYSTEM
.
18
ZIELSETZUNG
DIESER
ARBEIT
.
21
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
22
2.1
ZELLKULTUR
.
26
2.1.1
ZELLKULTURMEDIUM
UND
KULTURBEDINGUNGEN
.
26
2.1.2
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
.
26
2.1.3
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
26
2.2
VERGLEICH
DER
EIGENSCHAFTEN
VON
IMSCS,
N-MSCS
UND
AMSCS
.
27
2.2.1
FACS-ANALYSE
DER
OBERFLAECHENMARKER
.
27
2.2.2
OSTEOGENE
DIFFERENZIERUNG
.
28
2.2.3
MHC-EXPRESSION
NACH
OSTEOGENER
DIFFERENZIERUNG
.
29
2.2.4
CHONDROGENE
DIFFERENZIERUNG
.
29
2.2.4
ADIPOGENE
DIFFERENZIERUNG
.
31
2.2.6
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
.
32
2.2.7
BESTIMMUNG
DER
KLONIERUNGSEFFIZIENZ
MITTELS
EINES
EINZELLDRUCKERS
IN
ABWESENHEIT
BZW.
IN
ANWESENHEIT
VOM
ROCK-INHIBITOR
.
32
2.3
CRISPR/CAS9
VERMITTELTER
KNOCKOUT
VON
CI
ITA
UND
SS2M
.
34
2.3.1
HERSTELLUNG
VON
AGARPLATTEN
.
34
2.3.2
TRANSFORMATION
DER
PLASMIDE
IN
ESCHERICHIA
COLI
DH10
.
34
2.3.3
HERSTELLUNG
EINER
UEBERNACHTKULTUR
VON
BAKTERIEN
.
34
IV
2.3.4
VERVIELFAELTIGUNG
DER
PLASMIDE
.
35
2.3.5
VERIFIKATION
DER
PLASMIDE
.
36
2.3.6
TRANSFEKTION
DER
IMSCS
MIT
SS2M-,
CIITA
UND
KONTROLLPLASMIDEN
.
37
2.3.7
FACS-ANALYSE
DER
KOLONIEN
MIT
ANTIKOERPER
GEGEN
MHC-I,
SS2M
UND
MHC-II
IN
ANWESENHEIT
VON
INTERFERON
GAMMA
.
38
2.4
IN
VITRO
CHARAKTERISIERUNG
DER
KNOCKOUT
ZELLLINIEN
.
39
2.4.1
LIVE
DEAD
ASSAY
.
39
2.4.2
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
.
39
2.4.3
MSC-OBERFLAECHENMARKEREXPRESSION
.
39
2.4.4
NACHWEIS
DES
CIITA-KO
MIT
DEM
ALT-R
GENOME
EDITING
DETECTION
KIT.
40
2.5
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
.
42
2.5.1
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
MIT
DER
MIXED
LYMPHOCYTE
REACTION
.
42
2.6
STATISTISCHE
ANALYSE
.
44
3.
ERGEBNISSE
.
45
3.1
.
CHARAKTERISIERUNG
VON
VERSCHIEDENEN
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
.
45
3.1.1
FACS-ANALYSE
DER
OBERFLAECHENMARKER
.
45
3.1.2
OSTEOGENE
UND
CHONDROGENE
DIFFERENZIERUNG
.
48
3.1.3
MHC-EXPRESSION
NACH
OSTEOGENER
DIFFERENZIERUNG
BEI
IMSCS
.
50
3.1.4
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
.
51
3.1.5
BESTIMMUNG
DER
KLONIERUNGSEFFIZIENZ
VON
IMSC,
N-MSC
UND
AMSC
IN
ABWESENHEIT
BZW.
IN
ANWESENHEIT
DES
ROCK-INHIBITORS.
52
3.2
CRISPR/CAS-9
VERMITTELTER
KNOCKOUT
VON
CIITA
UND
SS2M
.
53
3.2.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VOM
SS2M-,
CIITA
UND
SCRAMBLED
PLASMID
MIT
UND
OHNE
KPNI-RESTRIKTIONSVERDAU
.
53
3.2.2
TRANSFEKTION
DER
IMSCS
MIT
SS2M-,
CIITA
UND
KONTROLLPLASMIDEN
.
54
3.3
IN
VITRO
CHARAKTERISIERUNG
DER
KNOCKOUT
ZELLLINIEN
.
58
3.3.1
MSC-OBERFLAECHENMARKEREXPRESSION
.
58
3.3.2
OSTEOGENE,
CHONDROGENE
UND
ADIPOGENE
DIFFERENZIERUNG
.
61
3.3.3
MESSUNG
DER
PROLIFERATION
VON
SS2M-,
CIITA
UND
KOMBINIERTER
32M/CIITA
KNOCKOUT
KOLONIEN
.
63
3.3.4
LIVE
DEAD
ASSAY
.
64
3.3.5
NACHWEIS
DES
CIITA-KO
MIT
DEM
ALT-R
GENOME
EDITING
DETECTION
KIT.
65
3.4
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
.
67
3.4.1
BESTIMMUNG
DER
IMMUNOGENITAET
IN
VITRO
MIT
DER
MIXED
LYMPHOCYTE
REACTION
.
67
4.
DISKUSSION
.
68
4.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
BESTEN
ISOLATIONSQUELLE
VON
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
68
4.1.1
MHC-EXPRESSION
NACH
OSTEOGENER
DIFFERENZIERUNG
.
71
4.2
DER
MHC-KNOCKOUT
VON
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
.
73
4.2.1
EFFEKT
DES
BIALLELEN
KNOCKOUTS
VON
CIITA
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
MHC-II
(HLA-DR)
IN
IMMORTALISIERTEN
MESENCHYMALEN
STAMMZELLENS
.
73
4.2.2
EFFEKT
DES
BIALLELEN
KNOCKOUTS
VON
SS-2-MIKROGLOBULINS
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
MHC-I
(HLA-A/-B/-C)
IN
IMMORTALISIERTEN
MESENCHYMALEN
STAMMZELLEN
.
74
4.2.3
WELCHE
EFFEKTE
HAT
DER
INDIVIDUELLE
BZW.
KOMBINIERTE
KNOCKOUT
VON
MHC-I
UND
MHC-II
AUF
RELEVANTE
ZELLPARAMETER
WIE
VITALITAET,
PROLIFERATION
UND
BIOMARKEREXPRESSION?
.
76
4.3 IMMUNOGENITAET
VON
KNOCKOUT-MSCS
.
78
4.3.1
WELCHE
EFFEKTE
HAT
DER
INDIVIDUELLE
BZW.
KOMBINIERTE
KNOCKOUT
VON
MHC-I
UND
MHC-II
AUF
DIE
IMMUNOGENITAET
DER
MSCS
IN
VITRO
UND
LASSEN
SICH
HIER
UNTERSCHIEDE
IN
DER
POTENZ
DER
BEIDEN
MHC-TYPEN
IN
BEZUG
AUF
DIE
VERMITTLUNG
DER
IMMUNOGENITAET
NACHWEISEN?
.
78
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
83
6.
AUSBLICK
.
84
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
85
VI
8.
PUBLIKATION
.
100
9.
LEBENSLAUF
.
101
10.
EIDESSTATTLICHE
VERSICHERUNG
.
102
11.
ERKLAERUNG
ZUM
EIGENANTEIL
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104
12.
DANKSAGUNG
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105
VII |
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| spelling | Halm, Darius 1998- Verfasser (DE-588)1263522815 aut Modulation der Immunogenität mesenchymaler Stammzellen durch den CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout der MHC-Komplexe vorgelegt 2021 von Darius Julian Halm Freiburg im Breisgau [2021] IX, 105 Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau 2022 3\p Mesenchymzelle (DE-588)4278308-2 gnd 4\p Stammzelle (DE-588)4665329-6 gnd 5\p Immunogenität (DE-588)4278029-9 gnd 6\p Tissue Engineering (DE-588)4646061-5 gnd 7\p Zelldifferenzierung (DE-588)4067536-1 gnd (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content B:DE-101 application/pdf https://d-nb.info/1264510225/04 Inhaltsverzeichnis DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=034565725&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis 1\p dnb 20221118 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#dnb 2\p emakn 0,20642 20220812 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#emakn 3\p emagnd 0,26131 20220812 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#emagnd 4\p emagnd 0,14497 20220812 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#emagnd 5\p emagnd 0,12587 20220812 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#emagnd 6\p emagnd 0,09493 20220812 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#emagnd 7\p emagnd 0,05761 20220812 DE-101 https://d-nb.info/provenance/plan#emagnd |
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Inhaltsverzeichnis