Holdings: Einfluss der onkogenen JAK2-Aktivierung auf die PD-L1-Expression und die T-Zell-Immunantwort in Myeloproliferativen Neoplasien

Einfluss der onkogenen JAK2-Aktivierung auf die PD-L1-Expression und die T-Zell-Immunantwort in Myeloproliferativen Neoplasien:

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Bibliographic Details
Main Author:	Emhardt, Alica-Joana (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	Freiburg im Breisgau [2022]
Subjects:	Tiermodell T-Lymphozyt Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................... IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................................... VI TABELLENVERZEICHNIS ........................................................................................................ VIII 1. EINLEITUNG .................................................................................................... 1 1.1. UEBERBLICK UEBER DIE ANTITUMORALE IMMUNANTWORT .......................................................... 1 1.1.1. UEBERBLICK UEBER DAS IMMUNOEDITING ...................................................................... 1 1.1.2. DIE ROLLE DER ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN ....................................................... 3 1.1.3. DIE BEDEUTUNG DES IMMUN-CHECKPOINTS............................................................. 3 1.1.4. UEBERBLICK UEBER DEN PD-1-SIGNALWEG ................................................................... 5 1.1.5. EINFLUSS VERSCHIEDENER GENETISCHER TUMORMUTATIONEN AUF DIE PD-L1-EXPRESSION ................................................................................................ 8 1.1.6. BEDEUTUNG DER PD-1-BLOCKADE FUER EINE ANTITUMORALE IMMUNANTWORT .................. 8 1.2. MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIEN UND DIE ROLLE DES JAK2-STAT3-SIGNALWEGS ............ 9 1.2.1. UEBERBLICK UEBER MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIEN ..................................................... 9 1.2.2. PATHOGENESE DER MPN ....................................................................................... 10 1.2.3. DER JAK2-STAT3-SIGNALWEG UND DIE ROLLE DER JAK2V617F MUTATION ............... 11 1.2.4. EPIDEMIOLOGIE UND KLINIK DER MPN ..................................................................... 13 1.2.5. DIAGNOSE UND KLINIK DER MPN ............................................................................ 13 1.2.6. UEBERBLICK UEBER POLYZYTHAEMIA VERA ..................................................................... 14 1.2.7. UEBERBLICK UEBER DIE ESSENTIELLE (ODER PRIMAERE) THROMBOZYTHAEMIE ..................... 15 1.2.8. PRIMAERE MYELOFIBROSE ......................................................................................... 15 2. MATERIAL ...................................................................................................... 18 2.1. HUMANE PROBEN ....................................................................................................... 18 2.2. MAUSSTAEMME ............................................................................................................ 18 2.3. ZELLLINIEN ................................................................................................................... 18 2.4. ZELLKULTUR: REAGENZIEN, KULTURMEDIEN UND INHIBITOREN ............................................. 19 2.5. PUFFER, CHEMIKALIEN, REAKTIONSSYSTEMANSAETZE UND REAGENZIEN ............................ 21 2.6. ANTIKOERPER UND VEKTOREN .............................................. 23 2.7. LABORGERAETE UND LABORBEDARF ................................................................................... 25 2.8. EDV-PROGRAMME ...................................................................................................... 25 3. METHODEN .................................................................................................. 26 3.1. ISOLATION HUMANER PBMCS (YYPERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS ) AUS EDTA-BLUT.26 3.2. GEWINNUNG PRIMAERER MURINER ZELLEN UND TRANSPLANTATIONSMODELL ........................... 26 3.2.1. SEKTION DER MAEUSE ........................................................................................ 26 3.2.2. GEWINNUNG MURINER T-ZELLEN ......................................................................... 26 3.2.3. GEWINNUNG VON MURINEM KNOCHENMARK ........................................................ 27 3.2.4. XENOTRANSPLANTATIONSMODELL .......................................................................... 27 3.2.5. CD-3 DEPLETION IM RAHMEN DES XENOTRANSPLANTATIONSMODELLS ..................... 27 3.2.6. GRUNDLAGE KNOCHENMARKINFEKTIONSMODELL ..................................................... 28 3.3. ZELLKULTURVERSUCHE .................................................................................................... 28 3.3.1. ZELLKULTURBEDINGUNGEN .................................................................................... 28 3.3.2. AUFTAUEN UND EINFRIEREN VON ZELLEN .............................. 28 3.3.3. ZELLZAEHLUNG ..................................................................................................... 29 3.3.4. BEHANDLUNG DER ZELLEN IN VITRO ....................................................................... 29 3.3.5. VERSUCHSAUFBAU KOKULTIVIERUNG PRIMAERER T-ZELLEN MIT JAK2 V617F -POSITIVEN ZELLEN .............................................................................................................. 29 3.3.6. STIMULATION VON T-ZELLEN ................................................................................. 30 3.3.7. ANALYSE DES ZELLSTOFFWECHSELS DURCH DEN SEAHORSE ASSAY ............................ 30 3.4. DURCHFLUSSZYTOMETRIE ................................................................................................ 31 3.4.1. ALLGEMEINES ZUR FACS-ANALYSE .................................................................... 31 3.4.2. EXTRAZELLULAERE OBERFLAECHENFAERBUNG ................................................................ 31 3.4.3. INTRAZELLULAERE FAERBUNG..................................................................................... 31 3.4.4. FAERBUNG DES GLUTAMINTRANSPORTERS SLC1A5 (ASCT2) ................................... 32 3.4.5. BESTIMMUNG PHOSPHORYLIERTER ANTIGENE MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE ............ 32 3.4.6. T-ZELL APOPTOSE ASSAY ................................................................................... 32 3.4.7. ZELLZYKLUSANALYSE VON T-ZELLEN MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE ........................ 33 3.5. WESTERN BLOT VERSUCHE ............................................................................................. 33 3.5.1. PROTEINEXTRAKTION AUS DEN ZELLEN ................................................................... 33 3.5.2. BICINCHONINIC ACID (BCA) ASSAY .................................................................... 34 3.5.3. GELELEKTROPHORESE .......................................................................................... 34 3.5.4. PROTEINTRANSFER ................................................................................................ 34 3.5.5. ANTIKOERPER-FAERBUNG ....................................................................................... 35 3.5.6. KAMERAAUFNAHME UND QUANTIFIZIERUNG .......................................................... 35 3.6. LUCIFERASE ASSAY ...................................................................................................... 35 3.6.1. KLONIERUNG DES PD-L1-PROMOTORS IN DEN LUCIFERASE REPORTER VEKTOR ............. 35 3.6.2. DURCHFUEHRUNG DES LUCIFERASE ASSAYS ............................................................ 37 3.7. AUSWERTUNG KNOCHENMARKSBIOPSIEN ....................................................................... 37 3.8. STATISTIK ..................................................................................................................... 38 4. ERGEBNISSE ............................................................................................... 39 4.1. EINFLUSS DES AKTIVIERTEN ONKOGENS JAK2 V617F AUF ERHOEHTE PD-L1-EXPRESSION VIA STAT3 PHOSPHORYLIERUNG ........................................................................................ 39 4.1.1. JAK2-AKTIVIERUNG ERHOEHT PD-L1-EXPRESSION AUF MURINEN ZELLEN ................... 39 II 4.1.2. JAK2-INHIBITION UND DEREN AUSWIRKUNG AUF DIE PD-L1-EXPRESSION MURINER ZELLEN .............................................................................................................. 41 4.1.3. STAT3 PHOSPHORYLIERUNG WIRD DURCH DIE JAK2V617F MUTATION BEEINFLUSST .... 42 4.1.4. JAK2-AKTIVIERUNG ERHOEHT DIE PD-L1-EXPRESSION AUF HUMANEN ZELLEN .......... 44 4.1.5. JAK2-INHIBITION UND DEREN AUSWIRKUNG AUF DIE PD-L1-EXPRESSION HUMANER ZELLEN .................................................................................... 45 4.1.6. DIE ONKOGENE AKTIVITAET VON JAK2V617F BEEINFLUSST DIE STAT3 PHOSPHORYLIERUNG IN HUMANEN ZELLLINIEN ........................................................ 48 4.1.7. AKTIVITAET DES PD-L1-PROMOTERS IN ABHAENGIGKEIT VON JAK2 V617F ...................... 52 4.2. HUMANE MEGAKARYOZYTEN VON MPN PATIENTEN EXPRIMIEREN HOHE PD-L1-WERTE .... 55 4.2.1. HOHE PD-L1-EXPRESSION AUF PBMCS VON JAK2 V617F -POSITIVEN MPN PATIENTEN .............................................................................................. 55 4.2.2. HOHE PD-L1-EXPRESSION AUF MEGAKARYOZYTEN VON JAK2 V617F -POSITIVEN MPN ..................................................................................................... 56 4.2.3. ERHOEHTE STAT3 PHOSPHORYLIERUNG IN MEGAKARYOZYTEN EINES MPN PATIENTEN ........................................................................................................ 58 4.3. PD-1-INHIBITION IM XENOGRAFT-MAUSMODELL VERBESSERT UEBERLEBENSRATEN .................. 60 4.4. EFFEKTORFUNKTION, ZELLZYKLUS UND METABOLISMUS VON T-ZELLEN WIRD DURCH PD-L1 EXPRIMIERENDE JAK2 V617F -MUTANTE ZELLEN EINGESCHRAENKT ................................. 62 4.4.1. VERAENDERTE EXPRESSION EINES T-ZELL-AMINOSAEURETRANSPORTERS NACH EXPOSITION GEGENUEBER JAK2 V617F -POSITIVEN ZELLEN ............................. 62 4.4.2. EXPOSITION GEGENUEBER JAK2 V617F -POSITIVEN ZELLEN BEEINFLUSST DEN T-ZELL METABOLISMUS ..................................................................................... 63 4.4.3. EINGESCHRAENKTE EFFEKTORFUNKTION VON T-ZELLEN NACH EXPOSITION GEGENUEBER JAK2 V617F -POSITIVEN ZELLEN .................................................................. 65 4.4.4. EXPOSITION GEGENUEBER JAK2 V617F -POSITIVEN ZELLEN BEEINFLUSST DEN ZELLZYKLUS VON T-ZELLEN ........................................................................ 66 4.5. PD1-INHIBITION ALS THERAPIEOPTION IN MPN BEI KRANKHEITSREZIDIV NACH ALLOGENER STAMMZELLTRANSPLANTATION ................................................................................. 67 5. DISKUSSION ................................................................................................ 69 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................... 76 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................................................... 77 PUBLIKATIONEN UND ERKLAERUNG ZUM EIGENANTEIL ................................................................ 88 LEBENSLAUF ....................................................................................................................... 90 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG .......................................................................................... 92 DANKSAGUNG .................................................................................................................... 93 III
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS . VI TABELLENVERZEICHNIS . VIII 1. EINLEITUNG . 1 1.1. UEBERBLICK UEBER DIE ANTITUMORALE IMMUNANTWORT . 1 1.1.1. UEBERBLICK UEBER DAS IMMUNOEDITING . 1 1.1.2. DIE ROLLE DER ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN . 3 1.1.3. DIE BEDEUTUNG DES IMMUN-CHECKPOINTS. 3 1.1.4. UEBERBLICK UEBER DEN PD-1-SIGNALWEG . 5 1.1.5. EINFLUSS VERSCHIEDENER GENETISCHER TUMORMUTATIONEN AUF DIE PD-L1-EXPRESSION . 8 1.1.6. BEDEUTUNG DER PD-1-BLOCKADE FUER EINE ANTITUMORALE IMMUNANTWORT . 8 1.2. MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIEN UND DIE ROLLE DES JAK2-STAT3-SIGNALWEGS . 9 1.2.1. UEBERBLICK UEBER MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIEN . 9 1.2.2. PATHOGENESE DER MPN . 10 1.2.3. DER JAK2-STAT3-SIGNALWEG UND DIE ROLLE DER JAK2V617F MUTATION . 11 1.2.4. EPIDEMIOLOGIE UND KLINIK DER MPN . 13 1.2.5. DIAGNOSE UND KLINIK DER MPN . 13 1.2.6. UEBERBLICK UEBER POLYZYTHAEMIA VERA . 14 1.2.7. UEBERBLICK UEBER DIE ESSENTIELLE (ODER PRIMAERE) THROMBOZYTHAEMIE . 15 1.2.8. 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