Verfügbarkeit: Haloferax volcanii

Haloferax volcanii: Untersuchung alternativer Funktionen der Endonuklease Cas1 über die CRISPR-Cas Immunabwehr hinaus

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Wörtz, Julia 1993- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Ulm 2022
Schlagworte:	Haloferax volcanii Gelchromatographie Mikroskopie Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	VII, 203 Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 1 1.1 ARCHAEA: DIE EXTREMOPHILEN VORFAHREN DER EUKARYA? ................................................ 1 1.2 HALOPHILE ARCHAEEN UND IHRE ANPASSUNGEN AN SALZREICHES MILIEU ........................... 3 1.3 DER HALOPHILE MODELLORGANISMUS HALOFERAX VOLCANII ..................................................4 1.4 DNA-REPARATUR IN H. VOLCANII ....................................................................................... 5 1.4.1 OXIDATIVE BASENSCHAEDEN ................................................................................ 6 1.4.2 HELIX-STRUKTUR UNTERBRECHENDE DNA-SCHAEDEN .............................................. 8 1.4.3 DNA-DOPPELSTRANGBRUECHE ............................................................................... 9 1.5 CRISPR-CAS: DAS ADAPTATIVE IMMUNSYSTEM DER PROKARYA ..................................... 12 1.5.1 AUFBAU UND FUNKTIONSWEISE VON CRISPR-CAS SYSTEMEN ......................... 13 1.5.2 DAS CRISPR-CAS TYP L-B SYSTEM IN H. VOLCANII ........................................ 17 1.6 ALTERNATIVE FUNKTIONEN VON CRISPR-CAS KOMPONENTEN ........................................ 19 1.6.1 MIKROBIELLE GENREGULATION UND VIRULENZ ....................................................... 19 1.6.2 DNA-REPARATUR ............................................................................................. 20 1.7 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT ........................................................................................... 21 2 MATERIAL ................................................................................................................................... 23 2.1 FILTER, SAEULEN, KITS UND MEMBRANEN ..........................................................................23 2.2 REAGENZIEN ................................................................................................................23 2.3 ANTIKOERPER ...................................................................................................................24 2.4 GROESSENSTANDARDS .......................................................................................................24 2.5 ENZYME .......................................................................................................................24 2.6 (OLIGO-) NUKLEOTIDE .....................................................................................................25 2.7 PLASMIDE .................................................................................................................... 27 2.8 STAEMME ....................................................................................................................... 30 2.9 NAEHRMEDIEN ................................................................................................................30 2.9.1 E. COLI NAEHRMEDIEN .......................................................................................30 2.9.2 H. VOLCANII MEDIENKOMPONENTEN .................................................................. 31 2.9.3 H. VOLCANII FLUESSIGMEDIEN ............................................................................ 32 2.9.4 H. VOLCANII NAEHRPLATTEN .................................................................................. 33 2.10 PUFFER UND LOESUNGEN .................................................................................................. 33 2.10.1 ANFERTIGUNG VON FLUESSIGRUECKLAGEN ............................................................. 33 2.10.2 E. COLI XL10-GOLD TRANSFORMATIONSLOESUNG ................................................ 34 2.10.3 ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS H. VOLCANII ..............................................34 2.10.4 H. VOLCANII TRANSFORMATIONSLOESUNGEN ........................................................ 34 2.10.5 NUKLEINSAEUREANALYTIK ..................................................................................35 2.10.6 PROTEINANALYTIK ............................................................................................ 36 IV 2.10.7 IN VITRO PROZESSIERUNGEN .............................................................................39 2.10.8 H2O2 UND NAOCI STAMMLOESUNGEN ............................................................. 40 2.10.9 GLYCOPROTEIN EXTRAKTION .............................................................................. 40 2.11 VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................................................... 40 2.12 LABORAUSSTATTUNG UND VERWENDETE GERAETE ................................................................ 41 2.13 SOFTWARE UND ONLINEPROGRAMME ............................................................................... 44 3 METHODEN ............................................................................................................................... 45 3.1 STANDARDMETHODEN ..................................................................................................... 45 3.2 ANFERTIGUNG VON FLUESSIGRUECKLAGEN ............................................................................. 45 3.3 TRANSFORMATIONEN ....................................................................................................... 45 3.3.1 E. COLI TRANSFORMATIONEN .............................................................................. 45 3.3.2 H. VOLCANII T ................................................................................................... 46 3.4 HERSTELLUNG VON PLASMIDEN ........................................................................................ 46 3.4.1 PLASMIDE ZUR ZELLLOKALISATION VON HVCASI .................................................. 47 3.4.2 PLASMIDE FUER DIE BESTAETIGUNG POTENZIELLER HVCASI INTERAKTIONSPARTNER. ...49 3.4.3 PLASMIDE FUER HVCASI UND HVFENL KOMPLEMENTATIONEN ........................... 51 3.5 ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS H. VOLCANII .............................................................53 3.6 HERSTELLUNG VON H. VOLCANII DELETIONSSTAEMMEN ........................................................ 53 3.6.1 POP-IN/POP-OUT METHODE ZUR ENTFERNUNG EINER GENOMISCHEN SEQUENZ.. ..53 3.6.2 SOUTHERN BLOT ANALYSE .................................................................................. 54 3.7 VERGLEICHENDE TRANSKRIPTOMANALYSEN ....................................................................... 56 3.7.1 RNA EXTRAKTION AUS H. VOLCANII .................................................................... 56 3.7.2 NEXT GENERATION RNA SEQUENZIERUNG .........................................................57 3.7.3 BIOINFORMATISCHE DATENANALYSE ...................................................................58 3.8 PROTEINANALYTIK ............................................................................................................58 3.8.1 UEBERPRODUKTION VON 3X FLAG-FUSIONSPROTEINEN ........................................58 3.8.2 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN .................................................................60 3.8.3 AUFREINIGUNG VON 3X FLAG-FUSIONSPROTEINEN AUS S100 EXTRAKTEN ........... 61 3.8.4 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE ......................................................... 62 3.8.5 WESTERN BLOT ANALYSE ...................................................................................62 3.8.6 FAERBUNG VON PROTEINEN IN PAA-GELEN .........................................................63 3.8.7 HERSTELLUNG VON HVCASI SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN ..................................... 64 3.8.8 GELFILTRATION ..................................................................................................... 66 3.8.9 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSEN VON FLAG-ELUATEN ............................ 66 3.9 DNA-REPARATUR EXPERIMENTE ....................................................................................67 3.9.1 H2O2UND NAOCI SENSITIVITAETSTESTS ..............................................................67 3.9.2 UV-STRAHLUNG SENSITIVITAETSTESTS ...................................................................68 3.9.3 GEZIELTE INDUKTION EINER AUTOIMMUNREAKTION .............................................. 69 V 3.9.4 PLASMID-BASIERTE REKOMBINATIONSTESTS ....................................................... 71 3.9.5 BERECHNUNG VON P-WERTEN MIT MICROSOFT EXCEL ........................................72 3.10 FLAP-SUBSTRAT IN VITRO PROZESSIERUNGEN ...................................................................73 3.10.1 SUBSTRATHERSTELLUNG ......................................................................................73 3.10.2 HERSTELLUNG DER S100 PROTEINEXTRAKTE FUER IVPS .......................................... 74 3.10.3 IVP REAKTIONSANSAETZE UND PAA-GELLAUF ................................................... 75 3.11 MIKROSKOPIE VON H. VOLCANII ........................................................................................ 75 3.11.1 LICHTMIKROSKOPIE ..........................................................................................76 3.11.2 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE .....................................................................76 3.12 DURCHFLUSSZYTOMETRIE .................................................................................................. 77 3.13 WACHSTUMSVERSUCHE ..................................................................................................77 3.14 GLYCOPROTEIN EXTRAKTION AUS H. VOLCANII ..................................................................... 78 4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................ 79 4.1 IN VIVO UEBERPRUEFUNG EINER BIOINFORMATISCH VORHERGESAGTEN TRANSMEMBRANDOMAENE IN HVCASI ............................................................................................................................... 79 4.1.1 DETEKTIONEN DER FLAG-MARKIERTEN PROTEINE HVCASI UND HVCASI ATM ...80 4.1.2 LOKALISATION VON FLUORESZENZMARKIERTEN HVCASI UND HVCASI ATM PROTEINEN ...................................................................................................................84 4.2 MIT WELCHEN PROTEINEN INTERAGIERT HVCASI ? ............................................................. 85 4.2.1 UEBERPRODUKTION UND CO-AUFREINIGUNG VON FLAG-CAS1 ..............................86 4.2.2 GELFILTRATION VON FLAG-CAS1 ELUATEN ...........................................................87 4.2.3 MASSENSPEKTROMETRIE ANALYSE ..................................................................... 90 4.2.4 CO-AUFREINIGUNGEN POTENZIELLER HVCASI INTERAKTIONSPARTNER ..................... 92 4.3 IST HVCASI AN DER ZELLULAEREN DNA-REPARATUR BETEILIGT? ..........................................95 4.3.1 BER: INDUKTION VON DNA-SCHAEDEN DURCH OXIDATIVEN STRESS ......................96 4.3.2 NER: INDUKTION VON DNA-SCHAEDEN DURCH UV-STRAHLUNG .......................... 103 4.3.3 MMEJ: IST HVCASI IN DIE REPARATUR VON CAS3 INDUZIERTEN DOPPELSTRANGBRUECHEN INVOLVIERT? ............................................................................ 105 4.3.4 HR: REKOMBINATIONSTESTS MIT EINER ACASL MUTANTE ................................ 111 4.4 IST HVCASI IN DER LAGE EIN TYPISCHES FEN1 SUBSTRAT ZU PROZESSIEREN? .............. 114 4.4.1 HERSTELLUNG EINER KATALYTISCH INAKTIVEN HVCASI MUTANTE .......................... 114 4.4.2 IN VITRO PROZESSIERUNGEN ............................................................................. 116 4.5 HERSTELLUNG UND PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG EINER ACASLAFENL MUTANTE ..118 4.5.1 GENERIERUNG EINES UECAS1L FEN1 DELETIONSSTAMMS .................................... 119 4.5.2 MIKROSKOPISCHE ANALYSEN ........................................................................... 120 4.5.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ................................................................................... 122 4.5.4 WACHSTU MSVERSUCHE .................................................................................. 124 4.5.5 TRANSKRIPTOMANALYSEN ................................................................................ 124 VI 5 DISKUSSION ............................................................................................................................ 128 5.1 IN VIVO UEBERPRUEFUNG EINER MOEGLICHEN TRANSMEMBRANDOMAENE IN HVCASI ........... 128 5.2 IDENTIFIKATION MOEGLICHER INTERAKTIONSPARTNER VON HVCASI ........................................ 130 5.2.1 HVCASI UND HVO_1 735 ............................................................................. 132 5.2.2 HVCASI UND RNASEN .................................................................................. 133 5.2.3 HVCASI UND CAS8 ....................................................................................... 134 5.3 HVCASI UND DNA-REPARATUR ................................................................................... 135 5.3.1 BER .............................................................................................................. 135 5.3.2 NER .............................................................................................................. 137 5.3.3 MMEJ UND HR ............................................................................................. 138 5.4 HVCASI PROZESSIERT FLAP-SUBSTRATE ...................................................................... 140 5.5 EIGENSCHAFTEN EINER ^CASLAFENL DOPPELMUTANTE .................................................. 141 6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................. 144 7 SUMMARY ..............................................................................................................................145 8 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................ 146 ANHANG ............................................................................................................................................. 169 A.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ 169 A.2 TABELLENVERZEICHNIS ................................................................................................. 171 A.3 ABKUERZUNGSVERZEICHNUS .......................................................................................... 172 A.4 ERGAENZENDE METHODEN ............................................................................................. 175 A.5 YYPHYRE2 UND YYTMPRED VORHERSAGEN ..................................................................... 176 A.6 ERGAENZENDE ABBILDUNGEN ........................................................................................ 179 A.7 MS DATEN ................................................................................................................. 180 A.8 DATENREIHEN DER DNA-REPARATURTESTS .................................................................... 182 A.9 DATENREIHEN DER WACHSTUMSVERSUCHE ................................................................... 187 A.10 CAS1 SEQUENZVERGLEICH MIT YYCLUSTAL OMEGA ........................................................ 191 A.11 TRANSKRIPTOMDATEN .................................................................................................. 192 A. 12 BEITRAEGE ANDERER ZU DIESER ARBEIT .......................................................................... 196 A.13 FUER DIESE ARBEIT GENERIERTE STAEMME UND PLASMIDE .............................................. 197 DANKSAGUNG .................................................................................................................................... 198 CURRICULUM VITAE ............................................................................................................................. 199 PUBLIKATIONSLISTE ............................................................................................................................. 200 KONFERENZBEITRAEGE .......................................................................................................................... 201 ERKLAERUNG UEBER IN ANSPRUCH GENOMMENE HILFEN ...................................................................... 202 VII
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG . 1 1.1 ARCHAEA: DIE EXTREMOPHILEN VORFAHREN DER EUKARYA? . 1 1.2 HALOPHILE ARCHAEEN UND IHRE ANPASSUNGEN AN SALZREICHES MILIEU . 3 1.3 DER HALOPHILE MODELLORGANISMUS HALOFERAX VOLCANII .4 1.4 DNA-REPARATUR IN H. VOLCANII . 5 1.4.1 OXIDATIVE BASENSCHAEDEN . 6 1.4.2 HELIX-STRUKTUR UNTERBRECHENDE DNA-SCHAEDEN . 8 1.4.3 DNA-DOPPELSTRANGBRUECHE . 9 1.5 CRISPR-CAS: DAS ADAPTATIVE IMMUNSYSTEM DER PROKARYA . 12 1.5.1 AUFBAU UND FUNKTIONSWEISE VON CRISPR-CAS SYSTEMEN . 13 1.5.2 DAS CRISPR-CAS TYP L-B SYSTEM IN H. VOLCANII . 17 1.6 ALTERNATIVE FUNKTIONEN VON CRISPR-CAS KOMPONENTEN . 19 1.6.1 MIKROBIELLE GENREGULATION UND VIRULENZ . 19 1.6.2 DNA-REPARATUR . 20 1.7 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT . 21 2 MATERIAL . 23 2.1 FILTER, SAEULEN, KITS UND MEMBRANEN .23 2.2 REAGENZIEN .23 2.3 ANTIKOERPER .24 2.4 GROESSENSTANDARDS .24 2.5 ENZYME .24 2.6 (OLIGO-) NUKLEOTIDE .25 2.7 PLASMIDE . 27 2.8 STAEMME . 30 2.9 NAEHRMEDIEN .30 2.9.1 E. COLI NAEHRMEDIEN .30 2.9.2 H. 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VOLCANII . 75 3.11.1 LICHTMIKROSKOPIE .76 3.11.2 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE .76 3.12 DURCHFLUSSZYTOMETRIE . 77 3.13 WACHSTUMSVERSUCHE .77 3.14 GLYCOPROTEIN EXTRAKTION AUS H. VOLCANII . 78 4 ERGEBNISSE . 79 4.1 IN VIVO UEBERPRUEFUNG EINER BIOINFORMATISCH VORHERGESAGTEN TRANSMEMBRANDOMAENE IN HVCASI . 79 4.1.1 DETEKTIONEN DER FLAG-MARKIERTEN PROTEINE HVCASI UND HVCASI ATM .80 4.1.2 LOKALISATION VON FLUORESZENZMARKIERTEN HVCASI UND HVCASI ATM PROTEINEN .84 4.2 MIT WELCHEN PROTEINEN INTERAGIERT HVCASI ? . 85 4.2.1 UEBERPRODUKTION UND CO-AUFREINIGUNG VON FLAG-CAS1 .86 4.2.2 GELFILTRATION VON FLAG-CAS1 ELUATEN .87 4.2.3 MASSENSPEKTROMETRIE ANALYSE . 90 4.2.4 CO-AUFREINIGUNGEN POTENZIELLER HVCASI INTERAKTIONSPARTNER . 92 4.3 IST HVCASI AN DER ZELLULAEREN DNA-REPARATUR BETEILIGT? .95 4.3.1 BER: INDUKTION VON DNA-SCHAEDEN DURCH OXIDATIVEN STRESS .96 4.3.2 NER: INDUKTION VON DNA-SCHAEDEN DURCH UV-STRAHLUNG . 103 4.3.3 MMEJ: IST HVCASI IN DIE REPARATUR VON CAS3 INDUZIERTEN DOPPELSTRANGBRUECHEN INVOLVIERT? . 105 4.3.4 HR: REKOMBINATIONSTESTS MIT EINER ACASL MUTANTE . 111 4.4 IST HVCASI IN DER LAGE EIN TYPISCHES FEN1 SUBSTRAT ZU PROZESSIEREN? . 114 4.4.1 HERSTELLUNG EINER KATALYTISCH INAKTIVEN HVCASI MUTANTE . 114 4.4.2 IN VITRO PROZESSIERUNGEN . 116 4.5 HERSTELLUNG UND PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG EINER ACASLAFENL MUTANTE .118 4.5.1 GENERIERUNG EINES UECAS1L\FEN1 DELETIONSSTAMMS . 119 4.5.2 MIKROSKOPISCHE ANALYSEN . 120 4.5.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE . 122 4.5.4 WACHSTU MSVERSUCHE . 124 4.5.5 TRANSKRIPTOMANALYSEN . 124 VI 5 DISKUSSION . 128 5.1 IN VIVO UEBERPRUEFUNG EINER MOEGLICHEN TRANSMEMBRANDOMAENE IN HVCASI . 128 5.2 IDENTIFIKATION MOEGLICHER INTERAKTIONSPARTNER VON HVCASI . 130 5.2.1 HVCASI UND HVO_1 735 . 132 5.2.2 HVCASI UND RNASEN . 133 5.2.3 HVCASI UND CAS8 . 134 5.3 HVCASI UND DNA-REPARATUR . 135 5.3.1 BER . 135 5.3.2 NER . 137 5.3.3 MMEJ UND HR . 138 5.4 HVCASI PROZESSIERT FLAP-SUBSTRATE . 140 5.5 EIGENSCHAFTEN EINER ^CASLAFENL DOPPELMUTANTE . 141 6 ZUSAMMENFASSUNG . 144 7 SUMMARY .145 8 LITERATURVERZEICHNIS . 146 ANHANG . 169 A.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS . 169 A.2 TABELLENVERZEICHNIS . 171 A.3 ABKUERZUNGSVERZEICHNUS . 172 A.4 ERGAENZENDE METHODEN . 175 A.5 YYPHYRE2 " UND YYTMPRED " VORHERSAGEN . 176 A.6 ERGAENZENDE ABBILDUNGEN . 179 A.7 MS DATEN . 180 A.8 DATENREIHEN DER DNA-REPARATURTESTS . 182 A.9 DATENREIHEN DER WACHSTUMSVERSUCHE . 187 A.10 CAS1 SEQUENZVERGLEICH MIT YYCLUSTAL OMEGA " . 191 A.11 TRANSKRIPTOMDATEN . 192 A. 12 BEITRAEGE ANDERER ZU DIESER ARBEIT . 196 A.13 FUER DIESE ARBEIT GENERIERTE STAEMME UND PLASMIDE . 197 DANKSAGUNG . 198 CURRICULUM VITAE . 199 PUBLIKATIONSLISTE . 200 KONFERENZBEITRAEGE . 201 ERKLAERUNG UEBER IN ANSPRUCH GENOMMENE HILFEN . 202 VII
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