Verfügbarkeit: Vergleich von PCR-Primersystemen zur Klonalitätsdiagnostik feliner Lymphome im Hinblick auf ihre Eignung für die Routinediagnostik

Vergleich von PCR-Primersystemen zur Klonalitätsdiagnostik feliner Lymphome im Hinblick auf ihre Eignung für die Routinediagnostik:

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Weyrich, Angelika (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Gießen VVB Laufersweiler Verlag 2022
Ausgabe:	1. Auflage
Schriftenreihe:	Edition Scientifique
Schlagworte:	cats diagnostic techniques lymphosarcoma diagnostic antigens immunodiagnosis polymerase chain reaction Katzen Lymphome Krebs Diagnose Diagnostik PCR Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	VI, 308 Seiten Illustrationen, Diagramme 21.5 cm x 14.8 cm, 800 g
ISBN:	9783835970748 3835970747

Internformat

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Datensatz im Suchindex

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adam_text	1 EINLEITUNG ........................................................................................... 1 2 LITERATURUEBERSICHT ............................................................................. 3 2.1 LYMPHOZYTEN .......................................................................................................... 3 2.1.1 DIE ANTIGENREZEPTOREN VON LYMPHOZYTEN ............................................................. 4 2.1.1.1 DER B-ZELL-REZEPTOR ............................................................................................... 4 2.1.1.2 DER T-ZELL-REZEPTOR ............................................................................................... 5 2.1.2 MECHANISMEN ZUR ERHOEHUNG DER ANTIGENREZEPTORDIVERSITAET VON LYMPHOZYTEN ......................................................................................................... 7 2.1.2.1 SOMATISCHES DNS-REARRANGEMENT ......................................................................... 7 2.1.2.2 SOMATISCHE HYPERMUTATION ................................................................................... 10 2.1.3 DIE ORGANISATION DER FELINEN B UND T-ZELLREZEPTORGENE .................................... 11 2.2 LYMPHOME ............................................................................................................. 12 2.2.1 IN DER VORLIEGENDEN STUDIE VERWENDETE LYMPHOME ............................................ 12 2.2.1.1 T-ZELL-LYMPHOME ................................................................................................ 12 2.2.1.1.1 INTESTINALES T-ZELL-LYMPHOM ............................................................................... 12 2.2.1.1.2 KUTANES EPITHELIOTROPES T-ZELL-LYMPHOM .......................................................... 13 2.2.1.1.3 NICHT NAEHER SPEZIFIZIERTES PERIPHERES T-ZELL-LYMPHOM ...................................... 13 2.2.1.2 B-ZELL-LYMPHOME ................................................................................................ 14 2.2.1.2.1 KLEINZELLIGES B-ZELL-LYMPHOM ............................................................................ 14 2.2.1.2.2 DIFFUSES GROSSZELLIGES B-ZELL-LYMPHOM .............................................................. 14 2.2.1.2.3 PLASMABLASTISCHES LYMPHOM ................................................................................ 14 2.2.1.2.4 FOLLIKULAERES LYMPHOM .......................................................................................... 15 2.2.1.2.5 MALT-LYMPHOM ................................................................................................. 15 2.2.2 LYMPHOMDIAGNOSTIK ............................................................................................. 15 2.2.2.1 ZYTOLOGIE UND HISTOLOGIE ...................................................................................... 16 2.2.2.2 IMMUNOPHAENOTYPISIERUNG ..................................................................................... 16 2.2.2.3 ANDERE METHODEN DER LYMPHOMDIAGNOSTIK ........................................................ 17 2.3 KLONALITAETSDIAGNOSTIK ............................................................................................ 17 2.3.1 PRINZIP DER METHODE ............................................................................................. 17 2.3.2 PCR-BASIERTE KLONALITAETSDIAGNOSTIK ..................................................................... 18 2.3.2.1 EINSATZ DER PCR-BASIERTEN KLONALITAETSDIAGNOSTIK IN DER HUMANMEDIZIN .......... 21 2.3.2.2 EINSATZ DER PCR-BASIERTEN KLONALITAETSDIAGNOSTIK IN DER VETERINAERMEDIZIN ...... 23 2.3.2.2.1 PCR-BASIERTE KLONALITAETSDIAGNOSTIK BEI DER KATZE ............................................. 26 2.3.2.2.1.1 T-ZELL-LYMPHOME ................................................................................................ 26 2.3.2.2.1.2 B-ZELL-LYMPHOME ................................................................................................ 29 2.3.2.3 GRENZEN DER PCR-BASIERTEN KLONALITAETSDIAGNOSTIK IN HUMAN UND VETERINAERMEDIZIN ................................................................................................ 33 3 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 36 3.1 PROBENMATERIAL ...................................................................................................... 36 3.1.1 VERWENDETE LYMPHOME ........................................................................................ 36 I 3.1.1.1 KRITERIEN ZUR AUSWAHL DER VERWENDETEN LYMPHOME .......................................... 41 3.1.1.2 HISTOPATHOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE DIAGNOSE UND KLASSIFIKATION .... 41 3.1.2 KONTROLLEN ............................................................................................................. 44 3.1.2.1 POLYKLONALE VERGLEICHSGRUPPE ............................................................................. 44 3.1.2.2 KLONALE KONTROLLEN .............................................................................................. 46 3.2 ISOLIERUNG DER DNS ............................................................................................... 46 3.2.1 FFPE-GEWEBE ....................................................................................................... 46 3.2.2 ZELLKULTURMATERIAL ................................................................................................. 47 3.2.3 UNFIXIERTES GEWEBE .............................................................................................. 48 3.3 UEBERPRUEFUNG DER DNS-KONZENTRATION UND -QUALITAET .......................................... 49 3.3.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG ....................................................... 49 3.3.2 AMPLIFIKATION VON PROBEFRAGMENTEN ................................................................... 50 3.4 AMPLIFIKATION DER ZIELSEQUENZEN ........................................................................ 52 3.4.1 PRIMERSYSTEME FUER T-ZELL-LYMPHOME ................................................................. 53 3.4.1.1 PRIMER NACH MOORE ET AL. (2005) ...................................................................... 53 3.4.1.2 PRIMER NACH WEISS ET AL. (2011) ........................................................................ 54 3.4.1.3 PRIMER NACH MOCHIZUKI ET AL. (2012) ............................................................. 58 3.4.1.4 PRIMER NACH ROUT ET AL. (2019) ......................................................................... 59 3.4.2 PRIMERSYSTEME FUER B-ZELL-LYMPHOME ................................................................. 60 3.4.2.1 PRIMER NACH WERNER ET AL. (2005) ................................................................... 60 3.4.2.2 PRIMER NACH HENRICH ET AL. (2009) ................................................................... 61 3.4.2.3 PRIMER NACH MOCHIZUKI ET AL. (2011) ............................................................. 62 3.4.2.4 PRIMER NACH ROUT ET AL. (2019) ......................................................................... 64 3.5 KAPILLARELEKTROPHORESE .......................................................................................... 65 3.5.1 ABI PRISM 310 GENETIC ANALYSER ...................................................................... 65 3.5.1.1 GERAETEAUFBAU ......................................................................................................... 66 3.5.1.2 VORBEREITUNG DER PROBEN ...................................................................................... 66 3.5.1.2.1 FLUORESZENZFARBSTOFFE .......................................................................................... 66 3.5.1.2.2 VORVERDUENNUNG DER PROBEN .................................................................................. 67 3.5.1.2.3 PROBENANSATZ ......................................................................................................... 67 3.5.1.3 INJ EKTIONS UND LAUFBEDINGUNGEN ........................................................................ 68 3.5.2 SOFTWARE-GESTUETZTE DATENANALYSE ......................................................................... 68 4 ERGEBNISSE ....................................................................................... 69 4.1 AUSWERTUNGSSYSTEM .............................................................................................. 69 4.1.1 ERGEBNISKATEGORIEN DER KLONALITAETSTESTUNG .......................................................... 69 4.1.2 BEGRIFFSDEFINITIONEN UND EINSCHLUSSKRITERIEN DER ERGEBNISKATEGORIEN DER KLONALITAETSTESTUNG ............................................................................................... 71 4.1.2.1 BEGRIFFSDEFINITIONEN .............................................................................................. 71 4.1.2.1.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH ..................................................................................... 71 4.1.2.1.2 UNSPEZIFISCHE UND SPEZIFISCHE PEAKS ................................................................... 72 4.1.2.1.3 FRAGLICHE DNS-QUALITAET ........................................................................................ 72 II 4.1.2.1.4 REPRODUZIERBARE UND NICHT REPRODUZIERBARE PEAKS ............................................. 72 4.1.2.1.5 MEHRERE PEAKS ...................................................................................................... 72 4.1.2.1.6 HINTERGRUNDRAUSCHEN ............................................................................................ 73 4.1.2.1.7 KLEINE PEAKS/GERINGE PEAKHOEHE ........................................................................... 73 4.1.2.2 EINSCHLUSSKRITERIEN DER KATEGORIEN ...................................................................... 73 4.1.2.2.1 YYKEINE (SPEZIFISCHEN) PEAKS .............................................................................. 73 4.1.2.2.2 YYEIN ODER ZWEI (KLEINE) SPEZIFISCHE REPRODUZIERBARE PEAKS .............................. 74 4.1.2.2.3 YYMEHRERE SPEZIFISCHE REPRODUZIERBARE PEAKS .................................................... 74 4.1.2.2.4 YYMIT HINTERGRUND ............................................................................................... 75 4.1.2.2.5 YYEIN ODER ZWEI SPEZIFISCHE NICHT REPRODUZIERBARE PEAKS .................................. 75 4.1.2.2.6 YYGAUSS-KURVE ...................................................................................................... 75 4.1.2.2.7 YYMEHRERE SPEZIFISCHE NICHT REPRODUZIERBARE PEAKS ........................................... 76 4.1.2.2.8 YYZU KEINER KATEGORIE GEHOEREND .......................................................................... 76 4.2 DNS-KONZENTRATION UND -QUALITAET ....................................................................... 79 4.2.1 ERGEBNISSE DER PHOTOMETRISCHEN BESTIMMUNG DER DNS-KONZENTRATION UND REINHEIT ................................................................................................................ 79 4.2.2 ERGEBNISSE DER PROBEAMPLIFIKATION MIT PRIMERPAAR GLCLVEXL2F UND GLCLV12R ....................................................................................... 79 4.2.3 ERGEBNISSE DER PROBEAMPLIFIKATION MIT PRIMERPAAR FCA740-F2 UND FCA740-R2 ......................................................................................................... 79 4.2.4 ERGEBNISSE DER PROBEAMPLIFIKATION MIT PRIMERPAAR AR-FW UND AR-REV ........... 79 4.3 AMPLIFIKATION DER ZIELSEQUENZEN ........................................................................ 80 4.3.1 T-ZELL-LYMPHOME . ............................................................................................. 80 4.3.1.1 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON MOORE ET AL. (2005) ................................ 80 4.3.1.1.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE ............................................... 80 4.3.1.1.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................. 80 4.3.1.1.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME ........................................ 80 4.3.1.1.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON MOORE ET AL. (2005) ................................................................. 81 4.3.1.2 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON WEISS ET AL. (2011) .................................. 81 4.3.1.2.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE ............................................... 82 4.3.1.2.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................. 82 4.3.1.2.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME ........................................ 83 4.3.1.2.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON WEISS ET AL. (2011) .................................................................... 84 4.3.1.3 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2012) ...................... 87 4.3.1.3.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE ............................................... 87 4.3.1.3.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................. 87 4.3.1.3.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME ........................................ 88 4.3.1.3.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2012) ......................................................... 88 4.3.1.4 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) .................................. 90 4.3.1.4.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE .............................................. 91 III 4.3.1.4.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................ 91 4.3.1.4.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME ....................................... 91 4.3.1.4.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) ..................................................................... 92 4.3.1.5 GEGENUEBERSTELLUNG DER UNTERSUCHTEN PRIMER-SYSTEME ZUM NACHWEIS VON TCRY-KLONALITAET ........................................................................ 93 4.3.2 B-ZELL-LYMPHOME (IGHV-, UNVOLLSTAENDIGES IGH-DJ-, IGL UND IGKDE GEN-REARRANGEMENT) .................................................................. 96 4.3.2.1 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON WERNER ET AL. (2005) ............................. 96 4.3.2.1.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-AMPLIFIKATE ............................................. 96 4.3.2.1.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................. 96 4.3.2.1.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME ........................................ 97 4.3.2.1.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON WERNER ET AL. (2005) ............................................................... 97 4.3.2.2 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON HENRICH ET AL. (2009) .......................... 101 4.3.2.2.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-AMPLIFIKATE ............................................ 101 4.3.2.2.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................ 101 4.3.2.2.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME ....................................... 102 4.3.2.2.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON HENRICH ET AL. (2009) ........................................................... 102 4.3.2.3 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2011) ..................... 105 4.3.2.3.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-AMPLIFIKATE ............................................ 105 4.3.2.3.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ............................................ 106 4.3.2.3.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME ....................................... 106 4.3.2.3.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2011) ............................................................................... 107 4.3.2.4 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) ................................. 111 4.3.2.4.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-, IGKDE UND IGL-AMPLIFIKATE ......... 112 4.3.2.4.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN ........................................... 112 4.3.2.4.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME ...................................... 113 4.3.2.4.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) ................................................................... 113 4.3.2.5 GEGENUEBERSTELLUNG DER UNTERSUCHTEN PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON IGHV-, IGKDE-UND IGL-KLONALITAET ........................................ 118 5 DISKUSSION .................................................................................... 121 5.1 ZIEL DER ARBEIT .................................................................................................... 121 5.2 ALLGEMEINE EINFLUSSFAKTOREN AUF DIE PCR-BASIERTE KLONALITAETSDIAGNOSTIK UND IHRE BEDEUTUNG FUER DIE ERGEBNISSE DIESER STUDIE ...................................... 121 5.2.1 PRAEANALYTISCHE UND ANALYTISCHE PHASE ............................................................... 121 5.2.1.1 VORUNTERSUCHUNGEN ............................................................................................ 121 5.2.1.2 PROBENAUSWAHL ................................................................................................... 122 5.2.1.3 ISOLIERUNG DER DNS ............................................................................................ 122 5.2.1.4 AUSWAHL DER PCR-TARGETS ................................................................................. 125 IV 5.2.1.5 DURCHFUEHRUNG DER PCR ....................................................................................... 127 5.2.1.6 GENESCAN-ANALYSE .............................................................................................. 129 5.2.2 AUSWERTUNGSPHASE .............................................................................................. 130 5.3 ANALYSE DER KLONALITAETSERGEBNISSE DER VERSCHIEDENEN PRIMERSYSTEME ............. 133 5.3.1 PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON T-ZELL-KLONALITAET (TCRY-GEN REARRANGEMENT) .................................................................................................. 133 5.3.1.1 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON MOORE ET AL. (2005) ......................... 133 5.3.1.2 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON WEISS ET AL. (2011) ........................... 134 5.3.1.3 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON MOCHIZUKI ET AL. (2012) ................ 136 5.3.1.4 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON ROUT ET AL. (2019) ............................ 137 5.3.1.5 GESAMTBETRACHTUNG DER GETESTETEN PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON T ZELL-KLONALITAET .................................................................................................... 138 5.3.2 PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON B-ZELL-KLONALITAET ...................................... 141 5.3.2.1 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON WERNER ET AL. (2005) .................... 141 5.3.2.2 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON HENRICH ET AL. (2009) ................... 142 5.3.2.3 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON MOCHIZUKI ET AL. (2011) .............. 143 5.3.2.4 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON ROUT ET AL. (2019) ........................... 143 5.3.2.5 GESAMTBETRACHTUNG DER GETESTETEN PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON B ZELL-KLONALITAET .................................................................................................... 145 5.3.3 UEBERTRAGUNG DER STUDIENERGEBNISSE AUF DIE KLONALITAETSDIAGNOSTIK IM ROUTINEEINSATZ AN FFPE-GEWEBE DER KATZE ..................................................... 147 5.4 ERGEBNISSE IM VERGLEICH ZUR BISHERIGEN STUDIENLAGE ....................................... 148 5.5 AUSBLICK .............................................................................................................. 149 6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................ 151 7 SUMMARY ....................................................................................... 153 8 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................... 154 9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ............................................................... 170 10 TABELLEN VERZEICHNIS ...................................................................... 173 11 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................. 175 12 ANHANG .......................................................................................... 177 12.1 TABELLEN .............................................................................................................. 177 12.2 SEQUENZEN DER ALS AMPLIFIKATIONSKONTROLLE VERWENDETEN PLASMIDE (HENRICH ET AL. 2009) .................................................................................... 295 12.3 VERWENDETE MATERIALIEN ..................................................................................... 295 12.3.1 HERKUNFTSNACHWEISE VON LABORGERAETEN UND EINMALARTIKELN ............................ 295 12.3.2 HERKUNFTSNACHWEISE VON CHEMIKALIEN, ENZYMEN, ANTIKOERPERN, SEREN UND KITS ..................................................................................................................... 300 V 12.3.3 HERSTELLUNGSWEISE VON LOESUNGEN, PUFFERN, GELEN SOWIE GERAETEZUBEHOER ....... 303 12.3.3.1 IMMUNHISTOLOGIE ................................................................................................ 303 12.3.3.2 DNS-EXTRAKTION ................................................................................................. 304 12.3.3.3 ABI PRISM 310 GENETIC ANALYSER ................................................................... 305 12.3.3.3.1 GLASKAPILLARE ...................................................................................................... 305 12.3.3.3.2 PUFFERLOESUNG ....................................................................................................... 305 12.3.3.3.3 POLYMER ............................................................................................................... 305 12.3.3.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE .................................................................................. 305 13 EIGENE PUBLIKATIONEN ................................................................... 307 14 DANKSAGUNG .................................................................................. 308 VI
adam_txt	1 EINLEITUNG . 1 2 LITERATURUEBERSICHT . 3 2.1 LYMPHOZYTEN . 3 2.1.1 DIE ANTIGENREZEPTOREN VON LYMPHOZYTEN . 4 2.1.1.1 DER B-ZELL-REZEPTOR . 4 2.1.1.2 DER T-ZELL-REZEPTOR . 5 2.1.2 MECHANISMEN ZUR ERHOEHUNG DER ANTIGENREZEPTORDIVERSITAET VON LYMPHOZYTEN . 7 2.1.2.1 SOMATISCHES DNS-REARRANGEMENT . 7 2.1.2.2 SOMATISCHE HYPERMUTATION . 10 2.1.3 DIE ORGANISATION DER FELINEN B UND T-ZELLREZEPTORGENE . 11 2.2 LYMPHOME . 12 2.2.1 IN DER VORLIEGENDEN STUDIE VERWENDETE LYMPHOME . 12 2.2.1.1 T-ZELL-LYMPHOME . 12 2.2.1.1.1 INTESTINALES T-ZELL-LYMPHOM . 12 2.2.1.1.2 KUTANES EPITHELIOTROPES T-ZELL-LYMPHOM . 13 2.2.1.1.3 NICHT NAEHER SPEZIFIZIERTES PERIPHERES T-ZELL-LYMPHOM . 13 2.2.1.2 B-ZELL-LYMPHOME . 14 2.2.1.2.1 KLEINZELLIGES B-ZELL-LYMPHOM . 14 2.2.1.2.2 DIFFUSES GROSSZELLIGES B-ZELL-LYMPHOM . 14 2.2.1.2.3 PLASMABLASTISCHES LYMPHOM . 14 2.2.1.2.4 FOLLIKULAERES LYMPHOM . 15 2.2.1.2.5 MALT-LYMPHOM . 15 2.2.2 LYMPHOMDIAGNOSTIK . 15 2.2.2.1 ZYTOLOGIE UND HISTOLOGIE . 16 2.2.2.2 IMMUNOPHAENOTYPISIERUNG . 16 2.2.2.3 ANDERE METHODEN DER LYMPHOMDIAGNOSTIK . 17 2.3 KLONALITAETSDIAGNOSTIK . 17 2.3.1 PRINZIP DER METHODE . 17 2.3.2 PCR-BASIERTE KLONALITAETSDIAGNOSTIK . 18 2.3.2.1 EINSATZ DER PCR-BASIERTEN KLONALITAETSDIAGNOSTIK IN DER HUMANMEDIZIN . 21 2.3.2.2 EINSATZ DER PCR-BASIERTEN KLONALITAETSDIAGNOSTIK IN DER VETERINAERMEDIZIN . 23 2.3.2.2.1 PCR-BASIERTE KLONALITAETSDIAGNOSTIK BEI DER KATZE . 26 2.3.2.2.1.1 T-ZELL-LYMPHOME . 26 2.3.2.2.1.2 B-ZELL-LYMPHOME . 29 2.3.2.3 GRENZEN DER PCR-BASIERTEN KLONALITAETSDIAGNOSTIK IN HUMAN UND VETERINAERMEDIZIN . 33 3 MATERIAL UND METHODEN . 36 3.1 PROBENMATERIAL . 36 3.1.1 VERWENDETE LYMPHOME . 36 I 3.1.1.1 KRITERIEN ZUR AUSWAHL DER VERWENDETEN LYMPHOME . 41 3.1.1.2 HISTOPATHOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE DIAGNOSE UND KLASSIFIKATION . 41 3.1.2 KONTROLLEN . 44 3.1.2.1 POLYKLONALE VERGLEICHSGRUPPE . 44 3.1.2.2 KLONALE KONTROLLEN . 46 3.2 ISOLIERUNG DER DNS . 46 3.2.1 FFPE-GEWEBE . 46 3.2.2 ZELLKULTURMATERIAL . 47 3.2.3 UNFIXIERTES GEWEBE . 48 3.3 UEBERPRUEFUNG DER DNS-KONZENTRATION UND -QUALITAET . 49 3.3.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG . 49 3.3.2 AMPLIFIKATION VON PROBEFRAGMENTEN . 50 3.4 AMPLIFIKATION DER ZIELSEQUENZEN . 52 3.4.1 PRIMERSYSTEME FUER T-ZELL-LYMPHOME . 53 3.4.1.1 PRIMER NACH MOORE ET AL. (2005) . 53 3.4.1.2 PRIMER NACH WEISS ET AL. (2011) . 54 3.4.1.3 PRIMER NACH MOCHIZUKI ET AL. (2012) . 58 3.4.1.4 PRIMER NACH ROUT ET AL. (2019) . 59 3.4.2 PRIMERSYSTEME FUER B-ZELL-LYMPHOME . 60 3.4.2.1 PRIMER NACH WERNER ET AL. (2005) . 60 3.4.2.2 PRIMER NACH HENRICH ET AL. (2009) . 61 3.4.2.3 PRIMER NACH MOCHIZUKI ET AL. (2011) . 62 3.4.2.4 PRIMER NACH ROUT ET AL. (2019) . 64 3.5 KAPILLARELEKTROPHORESE . 65 3.5.1 ABI PRISM 310 GENETIC ANALYSER . 65 3.5.1.1 GERAETEAUFBAU . 66 3.5.1.2 VORBEREITUNG DER PROBEN . 66 3.5.1.2.1 FLUORESZENZFARBSTOFFE . 66 3.5.1.2.2 VORVERDUENNUNG DER PROBEN . 67 3.5.1.2.3 PROBENANSATZ . 67 3.5.1.3 INJ EKTIONS UND LAUFBEDINGUNGEN . 68 3.5.2 SOFTWARE-GESTUETZTE DATENANALYSE . 68 4 ERGEBNISSE . 69 4.1 AUSWERTUNGSSYSTEM . 69 4.1.1 ERGEBNISKATEGORIEN DER KLONALITAETSTESTUNG . 69 4.1.2 BEGRIFFSDEFINITIONEN UND EINSCHLUSSKRITERIEN DER ERGEBNISKATEGORIEN DER KLONALITAETSTESTUNG . 71 4.1.2.1 BEGRIFFSDEFINITIONEN . 71 4.1.2.1.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH . 71 4.1.2.1.2 UNSPEZIFISCHE UND SPEZIFISCHE PEAKS . 72 4.1.2.1.3 FRAGLICHE DNS-QUALITAET . 72 II 4.1.2.1.4 REPRODUZIERBARE UND NICHT REPRODUZIERBARE PEAKS . 72 4.1.2.1.5 MEHRERE PEAKS . 72 4.1.2.1.6 HINTERGRUNDRAUSCHEN . 73 4.1.2.1.7 KLEINE PEAKS/GERINGE PEAKHOEHE . 73 4.1.2.2 EINSCHLUSSKRITERIEN DER KATEGORIEN . 73 4.1.2.2.1 YYKEINE (SPEZIFISCHEN) PEAKS " . 73 4.1.2.2.2 YYEIN ODER ZWEI (KLEINE) SPEZIFISCHE REPRODUZIERBARE PEAKS " . 74 4.1.2.2.3 YYMEHRERE SPEZIFISCHE REPRODUZIERBARE PEAKS " . 74 4.1.2.2.4 YYMIT HINTERGRUND " . 75 4.1.2.2.5 YYEIN ODER ZWEI SPEZIFISCHE NICHT REPRODUZIERBARE PEAKS " . 75 4.1.2.2.6 YYGAUSS-KURVE " . 75 4.1.2.2.7 YYMEHRERE SPEZIFISCHE NICHT REPRODUZIERBARE PEAKS " . 76 4.1.2.2.8 YYZU KEINER KATEGORIE GEHOEREND " . 76 4.2 DNS-KONZENTRATION UND -QUALITAET . 79 4.2.1 ERGEBNISSE DER PHOTOMETRISCHEN BESTIMMUNG DER DNS-KONZENTRATION UND REINHEIT . 79 4.2.2 ERGEBNISSE DER PROBEAMPLIFIKATION MIT PRIMERPAAR GLCLVEXL2F UND GLCLV12R . 79 4.2.3 ERGEBNISSE DER PROBEAMPLIFIKATION MIT PRIMERPAAR FCA740-F2 UND FCA740-R2 . 79 4.2.4 ERGEBNISSE DER PROBEAMPLIFIKATION MIT PRIMERPAAR AR-FW UND AR-REV . 79 4.3 AMPLIFIKATION DER ZIELSEQUENZEN . 80 4.3.1 T-ZELL-LYMPHOME . . 80 4.3.1.1 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON MOORE ET AL. (2005) . 80 4.3.1.1.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE . 80 4.3.1.1.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 80 4.3.1.1.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME . 80 4.3.1.1.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON MOORE ET AL. (2005) . 81 4.3.1.2 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON WEISS ET AL. (2011) . 81 4.3.1.2.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE . 82 4.3.1.2.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 82 4.3.1.2.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME . 83 4.3.1.2.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON WEISS ET AL. (2011) . 84 4.3.1.3 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2012) . 87 4.3.1.3.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE . 87 4.3.1.3.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 87 4.3.1.3.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME . 88 4.3.1.3.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2012) . 88 4.3.1.4 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) . 90 4.3.1.4.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER TRG-AMPLIFIKATE . 91 III 4.3.1.4.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 91 4.3.1.4.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-LYMPHOME . 91 4.3.1.4.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) . 92 4.3.1.5 GEGENUEBERSTELLUNG DER UNTERSUCHTEN PRIMER-SYSTEME ZUM NACHWEIS VON TCRY-KLONALITAET . 93 4.3.2 B-ZELL-LYMPHOME (IGHV-, UNVOLLSTAENDIGES IGH-DJ-, IGL UND IGKDE GEN-REARRANGEMENT) . 96 4.3.2.1 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON WERNER ET AL. (2005) . 96 4.3.2.1.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-AMPLIFIKATE . 96 4.3.2.1.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 96 4.3.2.1.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME . 97 4.3.2.1.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON WERNER ET AL. (2005) . 97 4.3.2.2 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON HENRICH ET AL. (2009) . 101 4.3.2.2.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-AMPLIFIKATE . 101 4.3.2.2.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 101 4.3.2.2.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME . 102 4.3.2.2.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON HENRICH ET AL. (2009) . 102 4.3.2.3 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2011) . 105 4.3.2.3.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-AMPLIFIKATE . 105 4.3.2.3.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 106 4.3.2.3.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME . 106 4.3.2.3.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON MOCHIZUKI ET AL. (2011) . 107 4.3.2.4 AMPLIFIKATION MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) . 111 4.3.2.4.1 ERWARTETER GROESSENBEREICH DER IGHV-, IGKDE UND IGL-AMPLIFIKATE . 112 4.3.2.4.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER KONTROLLPROBEN . 112 4.3.2.4.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNG DER B-ZELL-LYMPHOME . 113 4.3.2.4.4 ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE MIT DEN PRIMERN VON ROUT ET AL. (2019) . 113 4.3.2.5 GEGENUEBERSTELLUNG DER UNTERSUCHTEN PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON IGHV-, IGKDE-UND IGL-KLONALITAET . 118 5 DISKUSSION . 121 5.1 ZIEL DER ARBEIT . 121 5.2 ALLGEMEINE EINFLUSSFAKTOREN AUF DIE PCR-BASIERTE KLONALITAETSDIAGNOSTIK UND IHRE BEDEUTUNG FUER DIE ERGEBNISSE DIESER STUDIE . 121 5.2.1 PRAEANALYTISCHE UND ANALYTISCHE PHASE . 121 5.2.1.1 VORUNTERSUCHUNGEN . 121 5.2.1.2 PROBENAUSWAHL . 122 5.2.1.3 ISOLIERUNG DER DNS . 122 5.2.1.4 AUSWAHL DER PCR-TARGETS . 125 IV 5.2.1.5 DURCHFUEHRUNG DER PCR . 127 5.2.1.6 GENESCAN-ANALYSE . 129 5.2.2 AUSWERTUNGSPHASE . 130 5.3 ANALYSE DER KLONALITAETSERGEBNISSE DER VERSCHIEDENEN PRIMERSYSTEME . 133 5.3.1 PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON T-ZELL-KLONALITAET (TCRY-GEN REARRANGEMENT) . 133 5.3.1.1 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON MOORE ET AL. (2005) . 133 5.3.1.2 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON WEISS ET AL. (2011) . 134 5.3.1.3 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON MOCHIZUKI ET AL. (2012) . 136 5.3.1.4 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON ROUT ET AL. (2019) . 137 5.3.1.5 GESAMTBETRACHTUNG DER GETESTETEN PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON T ZELL-KLONALITAET . 138 5.3.2 PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON B-ZELL-KLONALITAET . 141 5.3.2.1 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON WERNER ET AL. (2005) . 141 5.3.2.2 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON HENRICH ET AL. (2009) . 142 5.3.2.3 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON MOCHIZUKI ET AL. (2011) . 143 5.3.2.4 TESTERGEBNISSE DES PRIMERSYSTEMS VON ROUT ET AL. (2019) . 143 5.3.2.5 GESAMTBETRACHTUNG DER GETESTETEN PRIMERSYSTEME ZUM NACHWEIS VON B ZELL-KLONALITAET . 145 5.3.3 UEBERTRAGUNG DER STUDIENERGEBNISSE AUF DIE KLONALITAETSDIAGNOSTIK IM ROUTINEEINSATZ AN FFPE-GEWEBE DER KATZE . 147 5.4 ERGEBNISSE IM VERGLEICH ZUR BISHERIGEN STUDIENLAGE . 148 5.5 AUSBLICK . 149 6 ZUSAMMENFASSUNG . 151 7 SUMMARY . 153 8 LITERATURVERZEICHNIS . 154 9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . 170 10 TABELLEN VERZEICHNIS . 173 11 ABBILDUNGSVERZEICHNIS . 175 12 ANHANG . 177 12.1 TABELLEN . 177 12.2 SEQUENZEN DER ALS AMPLIFIKATIONSKONTROLLE VERWENDETEN PLASMIDE (HENRICH ET AL. 2009) . 295 12.3 VERWENDETE MATERIALIEN . 295 12.3.1 HERKUNFTSNACHWEISE VON LABORGERAETEN UND EINMALARTIKELN . 295 12.3.2 HERKUNFTSNACHWEISE VON CHEMIKALIEN, ENZYMEN, ANTIKOERPERN, SEREN UND KITS . 300 V 12.3.3 HERSTELLUNGSWEISE VON LOESUNGEN, PUFFERN, GELEN SOWIE GERAETEZUBEHOER . 303 12.3.3.1 IMMUNHISTOLOGIE . 303 12.3.3.2 DNS-EXTRAKTION . 304 12.3.3.3 ABI PRISM 310 GENETIC ANALYSER . 305 12.3.3.3.1 GLASKAPILLARE . 305 12.3.3.3.2 PUFFERLOESUNG . 305 12.3.3.3.3 POLYMER . 305 12.3.3.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE . 305 13 EIGENE PUBLIKATIONEN . 307 14 DANKSAGUNG . 308 VI
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