Holdings: Einfluss Chromatin-modifizierender Faktoren auf die Pathogenese der Osteoporose am Beispiel der Lymphozytenspezifischen Helicase Lsh/HELLS

Einfluss Chromatin-modifizierender Faktoren auf die Pathogenese der Osteoporose am Beispiel der Lymphozytenspezifischen Helicase Lsh/HELLS:

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Bibliographic Details
Main Author:	Fuchs-Malucha, Katharina (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	Gießen VVB Laufersweiler Verlag 2021
Edition:	1. Auflage
Series:	Edition Scientifique
Subjects:	chromatin osteoporosis lymphocyte antigens lymphocytes Lymphozyten Knochen Osteoporose Hochschulschrift
Online Access:	Inhaltsverzeichnis
Physical Description:	XIX, 141 Seiten Illustrationen, Diagramme 21 cm x 14.8 cm, 250 g
ISBN:	9783835969698 3835969692

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................................................ I T ABELLENVERZEICHNIS ......................................................................................................................VI ABBILDUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................................. VIII ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................................. XVI 1. EINLEITUNG .................................................................................................................. 1 1.1 LSH/HELLS ................................................................................................................ 1 1.1.1 CHROMOSOMALE LOKALISATION UND MOLEKULARE STRUKTUR VON LSH/HELLS ................ 1 1.1.2 LOKALISATION VON LSH/HELLS IM GEWEBE ............................................................... 2 1.1.3 TIEREXPERIMENTELLE DATEN IM ZUSAMMENHANG MIT LSH/HELLS ............................. 2 1.2 EPIGENETIK .................................................................................................................. 3 1.2.1 DNA-METHYLIERUNG .................................................................................................. 4 1.2.2 HISTONMODIFIKATION ................................................................................................... 6 1.2.3 ONKOLOGIE UND EPIGENETIK ........................................................................................ 7 1.3 KNOCHENAUFBAU UND OSSIFIKATION ............................................................................. 8 1.4 EPIDEMIOLOGIE, PATHOPHYSIOLOGIE UND URSACHEN DER OSTEOPOROSE ........................ 9 1.4.1 EPIDEMIOLOGIE ......................................................................................................... 10 1.4.2 PATHOPHYSIOLOGIE ..................................................................................................... 10 1.4.3 MODIFIZIERBARE URSACHEN ........................................................................................ 10 1.4.4 BESCHRAENKT MODIFIZIERBARE RISIKOFAKTOREN: ERKRANKUNGEN UND MEDIKAMENTE.. 11 1.4.5 NICHT MODIFIZIERBARE RISIKOFAKOREN: GENETIK ...................................................... 11 1.4.6 EPIGENETIK UND OSTEOPOROSE ................................................................................... 12 1.5 SENESZENZ ................................................................................................................ 14 1.6 MESENCHYMALE STAMMZELLEN .................................................................................. 15 2. ZIELSETZUNG .............................................................................................................. 17 3. MATERIALIEN .............................................................................................................. 19 I 3.1 TABELLE 1: GERAETE ..................................................................................................... 19 3.2 TABELLE 2: VERBRAUCHSMATERIALIEN ......................................................................... 20 3.3 TABELLE 3: CHEMIKALIEN/REAGENZIEN ...................................................................... 22 3.4 TABELLE 4: ENZYME .................................................................................................. 25 3.5 TABELLE 5: KITS ......................................................................................................... 25 3.6 ZELLKULTURMEDIEN: ................................................................................................... 25 3.6.1 TABELLE 6: HMSC-TERT MEDIUM .............................................................................. 26 3.6.2 TABELLE 7: HEK293 MEDIUM .................................................................................. 26 3.6.3 TABELLE 8: HMSC UND MMSC MEDIUM ................................................................ 26 3.6.4 TABELLE 9: OSTEOGENES DIFFERENZIERUNGSMEDIUM .................................................. 26 3.6.5 TABELLE 10: ADIPOGENES DIFFERENZIERUNGSMEDIUM .............................................. 27 3.6.6 TABELLE 11: LB-BAKTERIENMEDIUM ......................................................................... 27 3.7 TABELLE 12: PRIMERSEQUENZEN ................................................................................. 27 3.8 VEKTOREN: ................................................................................................................. 30 3.8.1 PEGZ/MCS: ............................................................................................................ 30 3.8.2 PLENTI6.2/V5-DEST: .............................................................................................. 31 3.9 LOESUNGEN: ................................................................................................................ 31 3.9.1 TABELLE 13: DNA MARKER ....................................................................................... 31 3.9.2 TABELLE 14: DNTP (DESOXYRIBONUKLEOSIDTRIPHOSPHATE) ........................................ 32 3.9.3 TABELLE 15: TBE-PUFFER .......................................................................................... 32 3.9.4 TABELLE 16: PHOSPHATGEPUFFERTE SALZLOESUNG (PBS) ............................................... 32 3.9.5 TABELLE 17: SDS PAGE SAMMELGELPUFFER ............................................................... 32 3.9.6 TABELLE 18: SDS PAGE TRENNGELPUFFER .................................................................. 32 3.9.7 TABELLE 19: TBS PUFFER LOX (PH 7,2-7,4) ............................................................. 32 3.9.8 TABELLE 20: LAUFPUFFER ........................................................................................... 33 3.9.9 TABELLE 21: LOX TRANSFERPUFFER .............................................................................. 33 3.9.10 TABELLE 22: TRANSFERPUFFER ..................................................................................... 33 II 3.9.11 TABELLE 23: TBS/0,05% TWEEN 20 (TBST) ........................................................... 33 3.9.12 TABELLE 24: BLOCKLOESUNG ......................................................................................... 33 3.9.13 TABELLE 25: SDS TRENNGEL ...................................................................................... 33 3.9.14 TABELLE 26: SDS SAMMELGEL .................................................................................. 34 3.9.15 TABELLE 27: STRIPPING PUFFER ................................................................................... 34 3.9.16 TABELLE 28: ALIZARINROT-S-1 %-FAERBELOESUNG ........................................................... 34 3.9.17 TABELLE 29: OELROT-0 FAERBUNG .................................................................................. 34 3.9.18 KOSSA VAN GIESON FAERBUNG ..................................................................................... 34 3.10 TABELLE 34: PRIMAERE ANTIKOERPER .............................................................................. 35 3.11 TABELLE 3 5: SEKUNDAERE ANTIKOERPER ......................................................................... 35 3.12 TABELLE 36: ZELLEN ................................................................................................... 36 3.13 TABELLE 3 7: BAKTERIEN ............................................................................................. 36 3.14 KULTIVIERUNG DER E. COLI BAKTERIEN ......................................................................... 36 3.15 MAUSMODELL ............................................................................................................. 36 3.16 TABELLE 38: SOFTWARE UND INTERNETSEITEN ................................................................ 37 4. METHODEN ................................................................................................................. 38 4.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN ...................................................................................... 38 4.1.1 ISOLIERUNG DER HUMANEN UND MURINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN .................. 38 4.1.2 KULTIVIEREN UND PASSAGIEREN DER ZELLEN ................................................................ 38 4.1.3 ERNTE VON ZELLULAEREM PROTEIN .................................................................................. 39 4.1.4 ERNTE VON ZELLEN ZUR RNA ISOLATION ...................................................................... 39 4.1.5 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL ....................................................................................... 40 4.1.6 KRYOKONSERVIERUNG DER ZELLEN ............................................................................... 40 4.1.7 AUFTAUEN DER ZELLEN ................................................................................................ 40 4.1.8 DIFFERENZIERUNG DER MURINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN ............................... 41 4.1.9 ZYTOCHEMISCHE FAERBUNGEN ..................................................................................... 42 4.1.10 QUANTIFIZIERUNG DER FAERBUNGEN .............................................................................. 43 III 4.1.11 AUSLOESUNG DES ADIPOGENEN FARBSTOFFES ................................................................. 43 4.1.12 GEWINNUNG VON PLASMID DNA AUS BAKTERIEN ....................................................... 44 4.1.13 ANTIBIOTIKASELEKTION ................................................................................................ 44 4.1.14 TRANSFEKTIONEN ......................................................................................................... 44 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ............................................................................ 46 4.2.1 ISOLIERUNG VON RNA AUS ZELLEN .............................................................................. 46 4.2.2 ISOLIERUNG VON RNA AUS GEWEBE ........................................................................... 46 4.2.3 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER NUCLEINSAEUREN ........................................................ 47 4.2.4 CDNA-SYNTHESE ....................................................................................................... 47 4.2.5 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR): ........................................................................ 48 4.2.6 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (Q-PCR) ...................................................................... 49 4.2.7 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG .............................................................................. 50 4.2.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE .................................................................................... 50 4.2.9 WESTERN BLOT ............................................................................................................ 51 4.2.10 DENSITOMETRIE .......................................................................................................... 53 4.2.11 IMMUNPRAEZIPITATION ................................................................................................. 53 4.2.12 ELISA AUS SERUM .................................................................................................... 54 4.3 MAUSMODELL ............................................................................................................. 54 4.3.1 VERPAARUNG .............................................................................................................. 54 4.3.2 GENOTYPISIERUNG ...................................................................................................... 55 4.3.3 TOETEN, GEWICHTSKONTROLLE UND ABNAHME VON BLUT ................................................. 56 4.3.4 ISOLIERUNG UND AUFBEREITUNG DES GEWEBES FUER WEITERE UNTERSUCHUNGEN ............. 56 4.3.5 UNTERSUCHUNGEN DER GEWEBE ................................................................................. 57 4.4 STATISTISCHE AUSWERTUNG .......................................................................................... 59 5. ERGEBNISSE ............................................................................................................... 60 5.1 ERGEBNISSE AUS DEN IN VITRO VERSUCHEN .................................................................. 60 5.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER STABIL TRANSFIZIERTEN HMSC-TERT H (TERTH) ZELLEN ............. 60 IV 5.1.2 MORPHOLOGISCHE BEURTEILUNG DER TERT H-ZELLEN ................................................... 63 5.1.3 TRANSFEKTIONEN VON LSH/HELLS IN HUMANEN ZELLLINIEN MITTELS DES PEGZ-VEKTORS 63 5.1.4 DETEKTION VON LSH/HELLS ZIELGENEN ................................................................... 69 5.2 ERGEBNISSE AUS DEM TIEREXPERIMENTELLEN TEIL ........................................................ 70 5.2.1 GENOTYPISIERUNG DER MAEUSE ................................................................................... 70 5.2.2 PHAENOTYPISCHE BEWERTUNG DER MAEUSE ................................................................... 71 5.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER HETEROZYGOTEN LSH/HELLS KNOCK-OUT MAEUSE ANHAND DER GEWEBEPROBEN .............................................................................................................................. 73 5.2.4 CHARAKTERISIERUNG DER MURINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN ........................... 83 6. DISKUSSION ............................................................................................................. 102 6.1 ERGEBNISSE AUS DEN IN VITRO VERSUCHEN ............................................................... 102 6.1.1 DIE STABIL MIT LSH/HELLS TRANSFIZIERTE ZELLLINIE HMSC-TERT (TERTH) ............ 102 6.1.2 TRANSIENTE TRANSFEKTIONEN .................................................................................... 103 6.1.3 PROTEASOMINHIBITOR UND MICRORNA ..................................................................... 104 6.1.4 EINFLUSS VON LSH/HELLS AUF DIE GENEXPRESSION ................................................ 105 6.2 ERGEBNISSE AUS DEM TIEREXPERIMENTELLEN TEIL ...................................................... 105 6.2.1 DIE GENOTYPISIERUNG DER TIERE ............................................................................. 105 6.2.2 PHAENOTYP DER MAEUSE ............................................................................................. 106 6.2.3 UNTERSUCHUNGEN DER GEWEBE ............................................................................... 106 6.2.4 UNTERSUCHUNGEN AN MMSCS ................................................................................. 110 7. AUSBLICK ................................................................................................................ 118 8. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................ 119 9. SUMMARY ............................................................................................................... 121 10. LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................. 123 11. DANKSAGUNG .......................................................................................................... 140
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS . I T ABELLENVERZEICHNIS .VI ABBILDUNGSVERZEICHNIS . VIII ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . XVI 1. EINLEITUNG . 1 1.1 LSH/HELLS . 1 1.1.1 CHROMOSOMALE LOKALISATION UND MOLEKULARE STRUKTUR VON LSH/HELLS . 1 1.1.2 LOKALISATION VON LSH/HELLS IM GEWEBE . 2 1.1.3 TIEREXPERIMENTELLE DATEN IM ZUSAMMENHANG MIT LSH/HELLS . 2 1.2 EPIGENETIK . 3 1.2.1 DNA-METHYLIERUNG . 4 1.2.2 HISTONMODIFIKATION . 6 1.2.3 ONKOLOGIE UND EPIGENETIK . 7 1.3 KNOCHENAUFBAU UND OSSIFIKATION . 8 1.4 EPIDEMIOLOGIE, PATHOPHYSIOLOGIE UND URSACHEN DER OSTEOPOROSE . 9 1.4.1 EPIDEMIOLOGIE . 10 1.4.2 PATHOPHYSIOLOGIE . 10 1.4.3 MODIFIZIERBARE URSACHEN . 10 1.4.4 BESCHRAENKT MODIFIZIERBARE RISIKOFAKTOREN: ERKRANKUNGEN UND MEDIKAMENTE. 11 1.4.5 NICHT MODIFIZIERBARE RISIKOFAKOREN: GENETIK . 11 1.4.6 EPIGENETIK UND OSTEOPOROSE . 12 1.5 SENESZENZ . 14 1.6 MESENCHYMALE STAMMZELLEN . 15 2. ZIELSETZUNG . 17 3. MATERIALIEN . 19 I 3.1 TABELLE 1: GERAETE . 19 3.2 TABELLE 2: VERBRAUCHSMATERIALIEN . 20 3.3 TABELLE 3: CHEMIKALIEN/REAGENZIEN . 22 3.4 TABELLE 4: ENZYME . 25 3.5 TABELLE 5: KITS . 25 3.6 ZELLKULTURMEDIEN: . 25 3.6.1 TABELLE 6: HMSC-TERT MEDIUM . 26 3.6.2 TABELLE 7: HEK293 MEDIUM . 26 3.6.3 TABELLE 8: HMSC UND MMSC MEDIUM . 26 3.6.4 TABELLE 9: OSTEOGENES DIFFERENZIERUNGSMEDIUM . 26 3.6.5 TABELLE 10: ADIPOGENES DIFFERENZIERUNGSMEDIUM . 27 3.6.6 TABELLE 11: LB-BAKTERIENMEDIUM . 27 3.7 TABELLE 12: PRIMERSEQUENZEN . 27 3.8 VEKTOREN: . 30 3.8.1 PEGZ/MCS: . 30 3.8.2 PLENTI6.2/V5-DEST: . 31 3.9 LOESUNGEN: . 31 3.9.1 TABELLE 13: DNA MARKER . 31 3.9.2 TABELLE 14: DNTP (DESOXYRIBONUKLEOSIDTRIPHOSPHATE) . 32 3.9.3 TABELLE 15: TBE-PUFFER . 32 3.9.4 TABELLE 16: PHOSPHATGEPUFFERTE SALZLOESUNG (PBS) . 32 3.9.5 TABELLE 17: SDS PAGE SAMMELGELPUFFER . 32 3.9.6 TABELLE 18: SDS PAGE TRENNGELPUFFER . 32 3.9.7 TABELLE 19: TBS PUFFER LOX (PH 7,2-7,4) . 32 3.9.8 TABELLE 20: LAUFPUFFER . 33 3.9.9 TABELLE 21: LOX TRANSFERPUFFER . 33 3.9.10 TABELLE 22: TRANSFERPUFFER . 33 II 3.9.11 TABELLE 23: TBS/0,05% TWEEN 20 (TBST) . 33 3.9.12 TABELLE 24: BLOCKLOESUNG . 33 3.9.13 TABELLE 25: SDS TRENNGEL . 33 3.9.14 TABELLE 26: SDS SAMMELGEL . 34 3.9.15 TABELLE 27: STRIPPING PUFFER . 34 3.9.16 TABELLE 28: ALIZARINROT-S-1 %-FAERBELOESUNG . 34 3.9.17 TABELLE 29: OELROT-0 FAERBUNG . 34 3.9.18 KOSSA VAN GIESON FAERBUNG . 34 3.10 TABELLE 34: PRIMAERE ANTIKOERPER . 35 3.11 TABELLE 3 5: SEKUNDAERE ANTIKOERPER . 35 3.12 TABELLE 36: ZELLEN . 36 3.13 TABELLE 3 7: BAKTERIEN . 36 3.14 KULTIVIERUNG DER E. COLI BAKTERIEN . 36 3.15 MAUSMODELL . 36 3.16 TABELLE 38: SOFTWARE UND INTERNETSEITEN . 37 4. METHODEN . 38 4.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN . 38 4.1.1 ISOLIERUNG DER HUMANEN UND MURINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN . 38 4.1.2 KULTIVIEREN UND PASSAGIEREN DER ZELLEN . 38 4.1.3 ERNTE VON ZELLULAEREM PROTEIN . 39 4.1.4 ERNTE VON ZELLEN ZUR RNA ISOLATION . 39 4.1.5 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL . 40 4.1.6 KRYOKONSERVIERUNG DER ZELLEN . 40 4.1.7 AUFTAUEN DER ZELLEN . 40 4.1.8 DIFFERENZIERUNG DER MURINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN . 41 4.1.9 ZYTOCHEMISCHE FAERBUNGEN . 42 4.1.10 QUANTIFIZIERUNG DER FAERBUNGEN . 43 III 4.1.11 AUSLOESUNG DES ADIPOGENEN FARBSTOFFES . 43 4.1.12 GEWINNUNG VON PLASMID DNA AUS BAKTERIEN . 44 4.1.13 ANTIBIOTIKASELEKTION . 44 4.1.14 TRANSFEKTIONEN . 44 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN . 46 4.2.1 ISOLIERUNG VON RNA AUS ZELLEN . 46 4.2.2 ISOLIERUNG VON RNA AUS GEWEBE . 46 4.2.3 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER NUCLEINSAEUREN . 47 4.2.4 CDNA-SYNTHESE . 47 4.2.5 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR): . 48 4.2.6 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (Q-PCR) . 49 4.2.7 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG . 50 4.2.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE . 50 4.2.9 WESTERN BLOT . 51 4.2.10 DENSITOMETRIE . 53 4.2.11 IMMUNPRAEZIPITATION . 53 4.2.12 ELISA AUS SERUM . 54 4.3 MAUSMODELL . 54 4.3.1 VERPAARUNG . 54 4.3.2 GENOTYPISIERUNG . 55 4.3.3 TOETEN, GEWICHTSKONTROLLE UND ABNAHME VON BLUT . 56 4.3.4 ISOLIERUNG UND AUFBEREITUNG DES GEWEBES FUER WEITERE UNTERSUCHUNGEN . 56 4.3.5 UNTERSUCHUNGEN DER GEWEBE . 57 4.4 STATISTISCHE AUSWERTUNG . 59 5. ERGEBNISSE . 60 5.1 ERGEBNISSE AUS DEN IN VITRO VERSUCHEN . 60 5.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER STABIL TRANSFIZIERTEN HMSC-TERT H (TERTH) ZELLEN . 60 IV 5.1.2 MORPHOLOGISCHE BEURTEILUNG DER TERT H-ZELLEN . 63 5.1.3 TRANSFEKTIONEN VON LSH/HELLS IN HUMANEN ZELLLINIEN MITTELS DES PEGZ-VEKTORS 63 5.1.4 DETEKTION VON LSH/HELLS ZIELGENEN . 69 5.2 ERGEBNISSE AUS DEM TIEREXPERIMENTELLEN TEIL . 70 5.2.1 GENOTYPISIERUNG DER MAEUSE . 70 5.2.2 PHAENOTYPISCHE BEWERTUNG DER MAEUSE . 71 5.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER HETEROZYGOTEN LSH/HELLS KNOCK-OUT MAEUSE ANHAND DER GEWEBEPROBEN . 73 5.2.4 CHARAKTERISIERUNG DER MURINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN . 83 6. DISKUSSION . 102 6.1 ERGEBNISSE AUS DEN IN VITRO VERSUCHEN . 102 6.1.1 DIE STABIL MIT LSH/HELLS TRANSFIZIERTE ZELLLINIE HMSC-TERT (TERTH) . 102 6.1.2 TRANSIENTE TRANSFEKTIONEN . 103 6.1.3 PROTEASOMINHIBITOR UND MICRORNA . 104 6.1.4 EINFLUSS VON LSH/HELLS AUF DIE GENEXPRESSION . 105 6.2 ERGEBNISSE AUS DEM TIEREXPERIMENTELLEN TEIL . 105 6.2.1 DIE GENOTYPISIERUNG DER TIERE . 105 6.2.2 PHAENOTYP DER MAEUSE . 106 6.2.3 UNTERSUCHUNGEN DER GEWEBE . 106 6.2.4 UNTERSUCHUNGEN AN MMSCS . 110 7. AUSBLICK . 118 8. ZUSAMMENFASSUNG . 119 9. SUMMARY . 121 10. LITERATURVERZEICHNIS . 123 11. DANKSAGUNG . 140
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