Verfügbarkeit: Kombinierte Einzelzell-Charakterisierung von Genmutationen und aberranter DNA-Methylierung in Leukämien

Kombinierte Einzelzell-Charakterisierung von Genmutationen und aberranter DNA-Methylierung in Leukämien:

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Rhein, Janika (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Freiburg im Breisgau [2020]
Schlagworte:	Hochschulschrift
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Beschreibung:	141 Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm

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adam_text	INHALT 1 EINLEITUNG .......................................................................................................................... 1 1.1 AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE (AML) ........................................................................... 1 1.1.1 KLONALE HETEROGENITAET DER AML .......................................................................... 2 1.1.2 DNA METHYLIERUNG IN DER AML ............................................................................ 4 1.1.3 KLONALE HETEROGENITAET IN DER THERAPIE ................................................................ 7 1.2 EINZELZELL-ANALYSEN ALS GOLDSTANDARD......................................................................... 9 1.2.1 DIE ANALYSE VON GENMUTATIONEN UND DNA-METHYLIERUNG ................................... 9 1.2.2 VEREINZELUNG VON ZELLEN .................................................................................... 11 1.2.3 METHODEN DER DNA-METHYLIERUNGSANALYSE ....................................................... 14 1.2.4 SINGLE-CELL MULTIOMICS ...................................................................................... 15 1.3 ZIELSETZUNG DES VORLIEGENDEN PROJEKTES ................................................................... 18 2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................... 19 2.1 MATERIAL .................................................................................................................... 19 2.1.1 PROBENMATERIALIEN ............................................................................................ 19 2.1.2 OLIGONUKLEOTIDE ................................................................................................ 20 2.1.3 RESTRIKTIONSENZYME .......................................................................................... 21 2.1.4 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN........................................................................... 21 2.1.5 PUFFER ............................................................................................................... 21 2.1.6 KITS ................................................................................................................... 21 2.1.7 VERBRAUCHSMATERIALIEN ..................................................................................... 22 2.1.8 SONSTIGE MATERIALIEN ......................................................................................... 24 2.1.9 GERAETE .............................................................................................................. 24 2.1.10 BIOINFORMATISCHE SOFTWARE ................................................................................ 26 2.2 METHODEN ................................................................................................................. 27 2.2.1 ZELLKULTIVIERUNG ................................................................................................. 27 2.2.2 MATERIALGEWINNUNG ........................................................................................... 29 2.2.3 AUSWAHL VON MUTATIONS- UND METHYLIERUNGSSTELLE ............................................. 30 2.2.4 MULTIPLEX PROTOKOLLE ZUM GEMEINSAMEN NACHWEIS VON GENMUTATIONEN UND DNA- METHYLIERUNG IN EINZELZELLEN .......................................................................................... 31 2.2.5 PYROSEQUENZIERUNG .......................................................................................... 46 3 ERGEBNISSE ............................................................. 51 3.1 ZUSAMMENFASSUNG DES UEBERNOMMENEN PROJEKTES ................................................. 51 3.2 AUSWAHL EINER KONTROLL-ZELLLINIE ............................................................................... 51 3.2.1 MUTATIONSANALYSE VERSCHIEDENER ZELLLINIEN ...................................................... 52 3.2.2 ANALYSE DES METHYLIERUNGSGRADES POTENZIELLER KONTROLLZELLLINIEN ................... 53 3.2.3 ANALYSE VON HCT1 16 DNMT1,3B DKO ........................................................... 54 3.3 ETABLIERUNG DES MULTIPLEX PROTOKOLLS AUF GENOMISCHE DNA..................................... 57 3.3.1 MULTIPLEX PCR AUF GENOMISCHE KASUMI-1 DNA ............................................... 58 3.4 ETABLIERUNG DES MULTIPLEX PROTOKOLLS AUF EINZELZELLEN IN 200 PL PCR TUBES ........... 60 3.4.1 ENZYMTEST AUF LAMBDA DNA .......................................................................... 65 3.4.2 LINE1 PCR AUF EINZELZELLEN ............................................................................ 66 3.4.3 MULTIPLEX PCR PROTOKOLL AUF EINZELZELLEN EINES NEUEN ZELLSORT ........................ 68 3.5 ETABLIERUNG DES MULTIPLEX PCR PROTOKOLLS IN 384-WELL PLATTEN ................................ 71 3.5.1 ETABLIERUNG DES PROTOKOLLS AUF DNA IN 384-WELL PLATTEN .................................. 71 3.5.2 ETABLIERUNG DES PROTOKOLLS AUF EINZELZELLEN IN 384-WELL PLATTEN ...................... 72 3.6 VERGLEICH DER FORMATE 96-WELL UND 384-WELL ......................................................... 74 3.6.1 VERGLEICH VON 96-WELL CYCLER UND 384-WELL CYCLER .......................................... 74 3.6.2 EINFLUSS VON LYSE- UND CUT SMART PUFFER .......................................................... 76 3.6.3 VERWURF DES 384-WELL FORMATES ....................................................................... 77 3.7 MODIFIKATION DES PCR PROTOKOLLS IN 96-WELL PLATTEN................................................ 77 3.7.1 DEAKTIVIERUNG DES LYSE PUFFERS ........................................................................ 77 3.7.2 ETABLIERUNG DES TOUCH-DOWN FORMATES ........................................................... 79 3.7.3 DEAKTIVIERUNGSZEIT DES LYSE PUFFERS................................................................ 81 3.7.4 DEAKTIVIERUNGSSCHRITT IM MULTIPLEX PROTOKOLL ..................................................... 82 3.8 ANWENDUNG DES TOUCH-DOWN PCR PROTOKOLLS AUF EINZELZELLEN .............................. 84 3.9 ENTWICKLUNG DER KONTROLLEN FUER DEN MSRE-VERDAU ................................................. 88 3.9.1 ENTWICKLUNG VON KONTROLLEN MIT WGA DNA ...................................................... 88 3.9.2 ENTWICKLUNG VON KONTROLLEN MIT PCR PRODUKTEN .............................................. 90 3.10 MISCHVERSUCHE KASUMI-1 UND HCT1 16 DKO EINZELZELLEN .................................. 92 3.10.1 ANWENDUNG DES PROTOKOLLS AUF GETRENNTE EINZELZELLEN .................................... 92 3.10.2 ANWENDUNG DES PROTOKOLLS AUF ZUFAELLIG GEMISCHTE EINZELZELLEN ....................... 96 3.11 ANWENDUNG DES MULTIPLEX-PCR PROTOKOLLS AUF PATIENTENMATERIAL....................... 101 3.12 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER METHYLIERUNGSANALYSEN ....................... 105 3.12.1 METHYLIERUNGSANALYSE AM GENLOCUS DNMT3A-96%-207 ............................... 105 3.12.2 METHYLIERUNGSANALYSE DNMT3A-3%-1 96 ........................................................ 106 4 DISKUSSION .................................................................................................................... 107 4.1 METHODIK DES MULTIPLEX-PROTOKOLLS ......................................................................... 107 4.1.1 DIE GLEICHZEITIGE UNTERSUCHUNG VON GENMUTATIONEN UND DNA-METHYLIERUNG. 107 4.1.2 MSRE-VERDAU ZUR METHYLIERUNGSANALYSE ....................................................... 110 4.1.3 ANALYSE VON GENMUTATIONEN .......................................................................... 115 4.1.4 HERAUSFORDERUNGEN BEI DER MODIFIKATION DES MULTIPLEX-PROTOKOLLS.................. 116 4.2 ANWENDUNG DES MULTIPLEX-PROTOKOLLS ..................................................................... 122 4.2.1 DIE ERGEBNISSE DER METHYLIERUNGSANALYSE...................................................... 122 4.2.2 IDENTIFIKATION SPEZIFISCHER EINZELZELLEN IN EINER HETEROGENEN ZELLMISCHUNG ...123 4.2.3 ANWENDUNG DES VERSUCHSPROTOKOLLS AUF PATIENTENMATERIAL ........................... 124 4.3 FAZIT UND PERSPEKTIVE ............................................................................................ 125 4.3.1 FAZIT DES PROJEKTES......................................................................................... 125 4.3.2 PERSPEKTIVE .................................................................................................... 126
adam_txt	INHALT 1 EINLEITUNG . 1 1.1 AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE (AML) . 1 1.1.1 KLONALE HETEROGENITAET DER AML . 2 1.1.2 DNA METHYLIERUNG IN DER AML . 4 1.1.3 KLONALE HETEROGENITAET IN DER THERAPIE . 7 1.2 EINZELZELL-ANALYSEN ALS GOLDSTANDARD. 9 1.2.1 DIE ANALYSE VON GENMUTATIONEN UND DNA-METHYLIERUNG . 9 1.2.2 VEREINZELUNG VON ZELLEN . 11 1.2.3 METHODEN DER DNA-METHYLIERUNGSANALYSE . 14 1.2.4 SINGLE-CELL MULTIOMICS . 15 1.3 ZIELSETZUNG DES VORLIEGENDEN PROJEKTES . 18 2 MATERIAL UND METHODEN . 19 2.1 MATERIAL . 19 2.1.1 PROBENMATERIALIEN . 19 2.1.2 OLIGONUKLEOTIDE . 20 2.1.3 RESTRIKTIONSENZYME . 21 2.1.4 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN. 21 2.1.5 PUFFER . 21 2.1.6 KITS . 21 2.1.7 VERBRAUCHSMATERIALIEN . 22 2.1.8 SONSTIGE MATERIALIEN . 24 2.1.9 GERAETE . 24 2.1.10 BIOINFORMATISCHE SOFTWARE . 26 2.2 METHODEN . 27 2.2.1 ZELLKULTIVIERUNG . 27 2.2.2 MATERIALGEWINNUNG . 29 2.2.3 AUSWAHL VON MUTATIONS- UND METHYLIERUNGSSTELLE . 30 2.2.4 MULTIPLEX PROTOKOLLE ZUM GEMEINSAMEN NACHWEIS VON GENMUTATIONEN UND DNA- METHYLIERUNG IN EINZELZELLEN . 31 2.2.5 PYROSEQUENZIERUNG . 46 3 ERGEBNISSE . 51 3.1 ZUSAMMENFASSUNG DES UEBERNOMMENEN PROJEKTES . 51 3.2 AUSWAHL EINER KONTROLL-ZELLLINIE . 51 3.2.1 MUTATIONSANALYSE VERSCHIEDENER ZELLLINIEN . 52 3.2.2 ANALYSE DES METHYLIERUNGSGRADES POTENZIELLER KONTROLLZELLLINIEN . 53 3.2.3 ANALYSE VON HCT1 16 DNMT1,3B DKO . 54 3.3 ETABLIERUNG DES MULTIPLEX PROTOKOLLS AUF GENOMISCHE DNA. 57 3.3.1 MULTIPLEX PCR AUF GENOMISCHE KASUMI-1 DNA . 58 3.4 ETABLIERUNG DES MULTIPLEX PROTOKOLLS AUF EINZELZELLEN IN 200 PL PCR TUBES . 60 3.4.1 ENZYMTEST AUF LAMBDA DNA . 65 3.4.2 LINE1 PCR AUF EINZELZELLEN . 66 3.4.3 MULTIPLEX PCR PROTOKOLL AUF EINZELZELLEN EINES NEUEN ZELLSORT . 68 3.5 ETABLIERUNG DES MULTIPLEX PCR PROTOKOLLS IN 384-WELL PLATTEN . 71 3.5.1 ETABLIERUNG DES PROTOKOLLS AUF DNA IN 384-WELL PLATTEN . 71 3.5.2 ETABLIERUNG DES PROTOKOLLS AUF EINZELZELLEN IN 384-WELL PLATTEN . 72 3.6 VERGLEICH DER FORMATE 96-WELL UND 384-WELL . 74 3.6.1 VERGLEICH VON 96-WELL CYCLER UND 384-WELL CYCLER . 74 3.6.2 EINFLUSS VON LYSE- UND CUT SMART PUFFER . 76 3.6.3 VERWURF DES 384-WELL FORMATES . 77 3.7 MODIFIKATION DES PCR PROTOKOLLS IN 96-WELL PLATTEN. 77 3.7.1 DEAKTIVIERUNG DES LYSE PUFFERS . 77 3.7.2 ETABLIERUNG DES TOUCH-DOWN FORMATES . 79 3.7.3 DEAKTIVIERUNGSZEIT DES LYSE PUFFERS. 81 3.7.4 DEAKTIVIERUNGSSCHRITT IM MULTIPLEX PROTOKOLL . 82 3.8 ANWENDUNG DES TOUCH-DOWN PCR PROTOKOLLS AUF EINZELZELLEN . 84 3.9 ENTWICKLUNG DER KONTROLLEN FUER DEN MSRE-VERDAU . 88 3.9.1 ENTWICKLUNG VON KONTROLLEN MIT WGA DNA . 88 3.9.2 ENTWICKLUNG VON KONTROLLEN MIT PCR PRODUKTEN . 90 3.10 MISCHVERSUCHE KASUMI-1 UND HCT1 16 DKO EINZELZELLEN . 92 3.10.1 ANWENDUNG DES PROTOKOLLS AUF GETRENNTE EINZELZELLEN . 92 3.10.2 ANWENDUNG DES PROTOKOLLS AUF ZUFAELLIG GEMISCHTE EINZELZELLEN . 96 3.11 ANWENDUNG DES MULTIPLEX-PCR PROTOKOLLS AUF PATIENTENMATERIAL. 101 3.12 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER METHYLIERUNGSANALYSEN . 105 3.12.1 METHYLIERUNGSANALYSE AM GENLOCUS DNMT3A-96%-207 . 105 3.12.2 METHYLIERUNGSANALYSE DNMT3A-3%-1 96 . 106 4 DISKUSSION . 107 4.1 METHODIK DES MULTIPLEX-PROTOKOLLS . 107 4.1.1 DIE GLEICHZEITIGE UNTERSUCHUNG VON GENMUTATIONEN UND DNA-METHYLIERUNG. 107 4.1.2 MSRE-VERDAU ZUR METHYLIERUNGSANALYSE . 110 4.1.3 ANALYSE VON GENMUTATIONEN . 115 4.1.4 HERAUSFORDERUNGEN BEI DER MODIFIKATION DES MULTIPLEX-PROTOKOLLS. 116 4.2 ANWENDUNG DES MULTIPLEX-PROTOKOLLS . 122 4.2.1 DIE ERGEBNISSE DER METHYLIERUNGSANALYSE. 122 4.2.2 IDENTIFIKATION SPEZIFISCHER EINZELZELLEN IN EINER HETEROGENEN ZELLMISCHUNG .123 4.2.3 ANWENDUNG DES VERSUCHSPROTOKOLLS AUF PATIENTENMATERIAL . 124 4.3 FAZIT UND PERSPEKTIVE . 125 4.3.1 FAZIT DES PROJEKTES. 125 4.3.2 PERSPEKTIVE . 126
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