Immunoassays: ergänzende Methoden, Troubleshooting, regulatorische Anforderungen
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| Weitere Verfasser: | , |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Springer Spektrum
[2023]
|
| Ausgabe: | 2. Auflage |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis Klappentext |
| Beschreibung: | XXXII, 791 Seiten Illustrationen, Diagramme |
| ISBN: | 9783662626702 |
Internformat
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis 1 2 3 Einführung in Immunoassays........................................................................ Arnold Maria Raem, Claudia Goldman, Fabio Rizzo, Uwe Schedler, Fridtjof Lechhart und Enrico Pelz 1.1 Biologische Grundlagen der Immunoassays......................................... 1.2 Die adaptive Immunabwehr.................................................................... 1.3 Struktur und biologische Funktion der Antikörper............................... 1.4 Antikörper in der Analytik...................................................................... 1.5 Immunoassays - die Qual der Wahl....................................................... Antikörper.......................................................................................................... Rudolf Gruber 2.1 Struktur und Funktion............................................................................ 2.2 Affinität, Avidität und KD-Wert............................................................. 2.3 Immunisierung........................................................................................ 2.4 Monoklonale Antikörper........................................................................ 2.5 Humane monoklonale Antikörper, rekombinante, gentechnisch hergestellte Antikörper und Varianten.................................................. 2.6 Produktion.............................................................................................. 2.7 Aufreinigung/Extraktion....................................................................... 2.8
Konjugation........................................................................................... 2.9 Ende gut, Alles gut................................................................................. Weiterführende Literatur.................................................................................... ELISA/EIA/FIA................................................................................................ Göran Key 3.1 Historisches........................................................................................... 3.2 ELISA-Sy steme..................................................................................... 3.3 Bindung an die Oberfläche..................................................................... 3.4 Kopplung des Markerenzyms/Signalverstärkung................................... 3.5 Einsatz von Antikörperfragmenten......................................................... 3.6 Etablierung und Durchführung von ELISAs......................................... 1 2 4 6 8 11 21 22 32 34 37 39 42 44 48 51 51 53 53 54 56 58 59 59 XVII
XVIII 4 5 Inhaltsverzeichnis 3.7 Fluoreszenzimmunoassay............................................................................ 3.8 Rezepte......................................................................................................... Weiterführende Literatur......................................................................................... 68 69 70 Probenvorbereitung für Immunoassays.............................................................. 73 Verena Blättel-Born und Peter Sander 4.1 Probenaufarbeitung.................................................................................... 4.2 Die qualitative Bestimmung am Beispiel der Infektionsdiagnostik. ... 4.3 Die quantitative Bestimmung am Beispiel der Darmkrebsvorsorge ... Weiterführende Literatur......................................................................................... 73 76 79 82 Lateral-Flow-Immunoassays.................................................................................. 83 Matthias Lehmann 5.1 Lateral-Flow-Immunoassays - wie alles begann..................................... 5.2 Grundprinzip und Assayformate............................................................... 5.3 Produktentwicklung und regulatorische Anforderungen - ein Überblick...................................................................................... 89 5.4 Antikörper - der Schlüssel für einen robusten Assay............................... 5.5 Label und Konjugat.................................................................................... 5.6 Nichtbiologische
Assaykomponenten...................................................... 5.7 Assayoptimierung - die nächsten Schritte................................................ 5.8 Interpretation der Ergebnisse..................................................................... 5.9 Lateral-Flow-Immunoassay-Markt.......................................................... 5.10 Fazit............................................................................................................. Literatur.................................................................................................................... 6 Immuno-PCR: Anwendungsorientierte hochsensitive ProteinAnalytik mit Antikörper-DNA-Konjugaten.............................................. 95 98 101 107 109 113 115 116 119 Michael Adler 6.1 Was ist Immuno-PCR?................................................................................ 6.2 Wie funktioniert Immuno-PCR?............................................................... 6.3 Anwendungsbeispiel undpraktische Überlegungen zum Assayeinsatz: Cytokin IL-6...................................................................... 6.4 Ausblick....................................................................................................... Literatur.................................................................................................................... 7 83 85 Evolution der PCR - von der klassischen PCR zur digitalen PCR............. Patrick Gürtler und Sven Pecoraro 7.1 Evolution der Polymerasekettenreaktion..................................................
7.2 Digitale PCR.............................................................................................. 7.3 Unterschiede der digitalen PCR zur konventionellen PCR und Real-time PCR.............................................................................. 160 Literatur.................................................................................................................... 119 122 128 137 138 141 141 153 161
XIX Inhaltsverzeichnis 8 9 Die Detektion von Proteinen auf Membranen: Western-Blot- und Dot-Blot-Verfahren................................................................................................ 165 Thorsten Kuczius 8.1 Das Western-Blot-Verfahren.................................................................... 8.2 Das Dot-Blot-Verfahren.......................................................................... Literatur.............................................................................................................. 165 169 174 Beschleunigung des Western-Blotting.................................................................. Sabine Glöggler und Carina Vogt 177 9.1 Beschleunigung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).......................................................................................... 9.2 Beschleunigung des Blottens.................................................................. 9.3 Beschleunigung der Immundetektion..................................................... 9.4 Die Ein-Schritt-Reaktion........................................................................ 9.5 Markierung des Primärantikörpers......................................................... 9.6 Multiplex-Assays................................................................................... 9.7 Verwendung von alternativen Geräten................................................... Weiterführende Literatur.................................................................................... 177 179 180 180 183 184 185 186 10
Proteinarrays............................................................................................................ Johanna Sonntag und Matthias Griessner 189 10.1 Proteinarray-Formate............................................................................. 10.2 Oberflächenfunktionalisierung............................................................... 10.3 Layout von Proteinarrays....................................................................... 10.4 Detektionsverfahren und Auswertung................................................... 10.5 Anwendungen in Forschung undDiagnostik.......................................... Literatur.............................................................................................................. 190 197 199 201 204 208 Lab-on-a-Chip - Miniaturisierung von Assays für vor-Ortdiagnostische Anwendungen mittels Mikrofluidik........................................... 211 Jörg Nestler, Jenny Frank und Frank Bier 11.1 Mikrofluidik........................................................................................... 11.2 Materialien und Herstellungstechnologien für Chiplabore................... 11.3 Reagenzien-Vorlagerung....................................................................... 11.4 Detektion des Analyten ֊ Biosensoren................................................... 11.5 Mikro-Makro-Schnittstelle und Probenvorbereitung............................. 11.6 Anwendungsgebiete...............................................................................
Literatur.............................................................................................................. 212 218 220 222 226 228 229 Zuverlässige Proteinquantifizierung durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie............................................... 231 11 12 Patrick Opdensteinen und Johannes F. Buyel 12.1 Prinzipien der SPR-Spektroskopie zur Quantifizierung spezifischer Proteine.................................................................. 232
Inhaltsverzeichnis XX Verwendung von SPR zur Proteinquantifizierung und Bindungsanalyse............................................................................ 234 12.3 Quantifizierung von Proteintargets mittels spezifisch funktionalisierter Oberflächen.................................................... 235 12.4 Multiplex-Probenvorbereitung mit minimalem Aufwand..................... 12.5 Reproduzierbare Zielquantifizierung durch SPR auch ohne Standards...................................................................................... 239 12.6 Assayeinschränkungen und Fehlerbehebung.......................................... 12.7 Schlussfolgerung....................................................................................... Literatur.................................................................................................................... 12.2 13 14 16 246 248 248 Grundlagen moderner Methoden in der Durchflusszytometrie.................... 251 Malte Paulsen, Diana Rueda-Ordonez und Michelle Paulsen 13.1 TechnischeVoraussetzungen für hochparametrische Durchflusszytometrie................................................................... 251 13.2 Tipps für experimentelles Design von hochparametrischen Assays ... 13.3 Analyseansätze für hochparametrische Durchflusszytometrie............... 13.4 Zytometrie in der Ära der Genomik......................................................... Literatur.................................................................................................................... 268 274 280 284 Nachweismethoden zur Protein-
Interaktion..................................................... 285 Tobias Pusterla und Ann-Cathrin Volz 14.1 Zeitaufgelöste Fluoreszenz........................................................................ 14.2 Alpha-Technologie..................................................................................... 14.3 Ratiometrische Messungen zur Untersuchung der ProteinProtein-Interaktion ..................................................................................... 14.4 Fluoreszenzpolarisation ............................................................................ 14.5 Zusammenfassung..................................................................................... Literatur.................................................................................................................... 15 237 286 293 300 311 312 314 Immunhistochemie für Forschung und diagnostische Pathologie................ 317 Igor B. Buchwalow, Werner Böcker und Markus Tiemann 15.1 Fixierung.................................................................................................... 15.2 Antigendemaskierungstechniken............................................................... 15.3 Signalamplifikation (Signalverstärkung).................................................. 15.4 Multiple Immunfluoreszenzmarkierung.................................................... 15.5 Multiple Immunenzymmarkierung............................................................ 15.6 Hintergrundfärbung und Blockierungsschritte..........................................
Literatur.................................................................................................................... 318 319 320 323 328 332 334 Fluoreszenzmikroskopie in der Immunoassayanwendung - eine Einführung.......................................................................................................... 339 Klaus Nettesheim 16.1 Was ist Fluoreszenz?................................................................................. 340
Inhaltsverzeichnis XXI Prinzip und Auftau eines Fluoreszenzmikroskops................................ Aufbau eines Filterwürfels/Filterblocks.................................................. Lichtquellen für die Fluoreszenzmikroskopie........................................ Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops ................................................ Anwendungen für die Fluoreszenzmikroskopie...................................... Grenzen der Fluoreszenzmikroskopie .................................................... 343 343 346 347 349 349 17 In-vivo-Immunfärbung und intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie .... Marco Gallus und Maria Gabriele Bixel 17.1 Zwei-Photonen-Mikroskopie.................................................................. 17.2 Zwei-Photonen-Absorption ֊ Fluorophore, Autofluoreszenz und SHG/THG.................................................................................. 354 17.3 Intravitale Anwendungen der Zwei-Photonen-Mikroskopie.................. Literatur.............................................................................................................. 351 16.2 16.3 16.4 16.5 16.6 16.7 18 19 Quantitative digitalholografische Phasenkontrastmikroskopie biophysikalische Charakterisierung von immunologischen Prozessen, Zellen und Geweben................................................................................ 369 Björn Kemper, Thomas Liedtke und Jürgen Schnekenburger 18.1 Quantitative digitalholografische Phasenkontrastmikroskopie ............. 18.2 Zellidentifizierung und
Zellkulturqualitätskontrolle............................. 18.3 Markerfireie In-vitro-Toxizitätsanalyse am Beispiel von Makrophagen........................................................................................ 18.4 Quantifizierung von Entzündung im Gewebe...................................... Literatur.............................................................................................................. Zirkulierende Tumorzellen - Isolation und molekulare Charakterisierung.................................................................................... 379 Caroline Werner und Gabriele Multhoff 19.1 Methoden der Isolation von CTCs........................................................ 19.2 СТС-Isolierung mittels S-pluriBeads®.................................................. 19.3 Identifizierung von CTCs über immunzytochemische Färbung............ Literatur.............................................................................................................. 20 Automatisierte Isolation zirkulierender Tumorzellen für die Liquid Biopsy........................................................................................................ 389 Sabine Alebrand, Christian Freese, Janis Stiefel, Arnold Maria Raem und Michael Baßler 20.1 Die Liquid Biopsy als Zukunftstechnologie in der Diagnostik............. 20.2 CTCs als Biomarker: Ziele und Herausforderungen............................. 20.3 Methoden der Anreicherung seltener Zellen aus Vollblut.................... 20.4 Vereinzelung von
CTCs........................................................................ 20.5 Automatisierung der Anreicherung, Identifikation und Vereinzelung von CTCs........................................................... 399 351 357 367 370 372 373 376 378 380 383 386 386 389 393 393 397
Inhaltsverzeichnis XXII Das CTCelect-System: Technologie zur vollautomatisierten Isolation zirkulierender Tumorzellen aus Vollblut.................... 404 20.7 Der Weg zur personalisierten Medizin..................................................... Literatur..................................................................................................................... 408 409 3D-Zell-und Organoidkultur................................................................................ 411 Kevin Achberger, Lena Antkowiak und Stefan Liebau 21.1 Die Möglichkeiten der 3D-Kulturverfahren............................................. 21.2 Organoide.................................................................................................... 21.3 Vom Organoid zum Organ......................................................................... 21.4 Zusammenfassung...................................................................................... Literatur.................................................................................................................... 412 414 429 433 433 Tissue Engineering und Regenerative Medizin................................................. 435 Valentin Kerkfeld und Ulrich Meyer 22.1 Angeborene Immunität............................................................................... 22.2 Adaptive Immunität................................................................................... Literatur.................................................................................................................... 439 441 444 20.6 21 22
23 24 25 Die CRISPR/Cas-Technologie: Klassische und zukünftige Anwendungen in der Molekularbiologie und Medizin........................... 447 Claudia Rutz und Ralf Schülein 23.1 Einleitung: Der Ursprung von CRISPR/Cas - vom bakteriellen Immunsystem zur universellenGenmodifizierungsmethode..... 447 23.2 Die Anwendungen von CRISPR/Cas........................................................ 23.3 CRISPR/Cas: Die Praxis............................................................................ 23.4 Schlussbemerkungen.................................................................................. Weiterführende Literatur......................................................................................... 450 459 462 462 Fluoreszenzfarbstoffe............................................................................................... 465 Lutz Haalck 24.1 Kleine Farbenlehre...................................................................................... 24.2 Charakterisierung von Fluoreszenzfarbstoffen.......................................... 24.3 Instrumentelle Voraussetzungen................................................................. 24.4 Neuere Entwicklungenin der Fluoreszenzmikroskopie........................... 24.5 Praktischer Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen........................................ 24.6 Herstellung von Antikörper-Fluorophor-Konjugaten............................... Weiterführende Literatur......................................................................................... 468 469 471 474 475 477 484 Oberflächen und
Immobilisierung....................................................................... 487 Peter Esser, Thomas Andersen und Vibeke Rowell 25.1 Prinzipien der passiven Adsorption an Polystyrol................................... 25.2 Die Wahl der richtigen Oberfläche............................................................ 487 496
Inhaltsverzeichnis Oberflächen für kovalente Bindung...................................................... Immobilisierung von DNA.................................................................... 499 504 Stabilisierung von Assaykomponenten.............................................................. 507 Angela Zellmer, Manuel Hecht und Peter Rauch 26.1 Stabilisierung immobilisierter Fängerantikörper.................................. 26.2 Stabilisierung der Standards und Kontrollen........................................ 26.3 Stabilisierung der Detektorantikörper.................................................. Weiterführende Literatur.................................................................................... 508 513 515 519 25.3 25.4 26 27 28 Störeffekte bei Immunoassays............................................................................. Peter Rauch und Tobias Polifke 27.1 StörungendurchOberflächeneffekte ..................................................... 27.2 Störungen durch Immunoassay-Label................................................... 27.3 Störungen durch Assayantikörper......................................................... 27.4 Störungen durch Kreuzreaktionen und unspezifische Bindungen......... 27.5 Der High-Dose-Hook-Effekt................................................................. 27.6 Vermeidung von Störeffekten................................................................. Weiterführende Literatur.................................................................................... 521 522 524 525 532 534 534 537
Troubleshooting und Hilfestellungen bei der Entwicklung, Validierung und Durchführung von ELISAs........................................... 539 Peter Schneider und Anna Funk 28.1 Das ELISA-Test-Format......................................................................... 28.2 Schlüsselreagenzien und Hilfsreagenzien............................................. 28.3 Die Bedeutung der Antikörperqualität.................................................. 28.4 Herstellung eigener Antikörper............................................................. 28.5 Haptenkonjugate mit Enzymen und Trägerproteinen sowie Haptenmodifikationen.......................................................................... 28.6 Kriterien zur Einstellung von ELISA-Tests........................................... 28.7 Einfluss spezieller Puffersysteme........................................................... 28.8 Beschichtung und Stabilisierung der beschichteten Oberflächen von Mikrotiterplatten............................................................................ 28.9 Probenmatrix und Probenvorbereitung................................................... 28.10 Häufige Fehler und deren mögliche Ursachen...................................... 28.11 Weitere Interferenzen insbesondere bei der Bestimmung klinischer Proben..................................................................... 552 28.12 Zusammenfassung.................................................................................
Literatur.............................................................................................................. 29 XXIII 540 541 542 543 544 546 548 550 551 552 554 555 Auswertung und Validierung............................................................................... 557 Tobias Polifke und Peter Rauch 29.1 Ausreißertests........................................................................................ 29.2 Validierung von Immunoassays............................................................ 558 560
Inhaltsverzeichnis XXIV 30 29.3 Fazit............................................................................................................ Literatur.................................................................................................................... 570 571 Lebensmittel- und Futtermittelanalytik.............................................................. 573 Markus Laconi und Thomas Hektor 30.1 Probenahme................................................................................................ 30.2 Probenaufarbeitung................................................................................... 30.3 Kalibration.................................................................................................. 30.4 Ermittlung von Leistungsdaten: Validierung von Immunoassays in der Lebensmittelanalytik...................................................................... 30.5 Bewertung eines Ergebnisses..................................................................... 30.6 Grenzen eines Messsystems....................................................................... Weiterführende Literatur......................................................................................... 31 32 33 576 577 579 581 589 591 592 Automatisierung von Immunoassays.......................... 593 Matthias Herkert und Nikolas Vogel 31.1 Problemfelder bei der Automatisierung................................................... 31.2 Zusammenfassung..................................................................................... Weiterführende
Literatur......................................................................................... 594 606 607 Präanalytische Qualitätssicherung durchzuverlässige Probenstabilisierung und -logistik............................... 609 Kateryna Shreder, Ullrich Stahlschmidt und Georg Klopfer 32.1 Stabilisierung von zellfreier DNA (cfDNA).............................................. 32.2 Stabilisierung von zirkulierenden Tumorzellen........................................ 32.3 Stabilisierung von zellfreier RNA (cfRNA).............................................. 32.4 Stabilisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs)................................... Literatur.................................................................................................................... 610 612 613 614 614 Herausforderungen für ein Next Generation Biobanking Kryokonservierung für die Weiterentwicklung der personalisierten Medizin......................................................................................................................... 617 Christian Stephan, Günther Winde, Enrico Pelz und Arnold Maria Raem 33.1 Was ist eine Biobank - Definition und Funktion..................................... 33.2 Welche Bedeutung haben Biobanken in der modernen Medizin?......... 33.3 Was sind aktuell limitierende Faktoren des Biobankings?...................... 33.4 Voll automatisierte Kryokonservierung durch UltratiefkühlLagerung?...................................................................................... 630 33.5 Was sind wichtige Elemente für eine modern funktionierende
Biobank?........................................................................................ 632 33.6 Ausblick...................................................................................................... Literatur.................................................................................................................... 617 619 623 634 635
Inhaltsverzeichnis XXV 34 637 Volker Franzen und Thomas Klütz 34.1 Was sind In-vitro-Diagnostika? ............................................................. 638 34.2 Der neue Rechtsrahmen......................................................................... 638 34.3 Zweckbestimmung................................................................................. 644 34.4 Klassifizierungsregeln ........................................................................... 645 34.5 Konformitätsbewertung......................................................................... 646 34.6 Von den Benannten Stellen zu erfüllende Anforderungen..................... 649 34.7 Allgemeine Sicherheits- und Leistungsanforderungen......................... 650 34.8 Technische Dokumentation................................................................... 653 34.9 Das neue Konzept der Leistungsbewertung........................................... 654 34.10 Harmonisierte Normen, gemeinsame Spezifikationen und Stand der Technik............................................................................... 658 34.11 Das neue europäische elektronische Informationssystem für Medizinprodukte................................................... 658 34.12 System für die Überwachung nach dem Inverkehrbringen................... 659 34.13 Vigilanz................................................................................................. 660 34.14 Für die Einhaltung der RegulierungsVorschriften verantwortliche
Person....................................................................................... 660 34.15 Produkte zur Eigenherstellung in Gesundheitseinrichtungen............... 661 34.16 Grafische Übersicht über die Anforderungen der IVD-VO................... 661 34.17 Fazit....................................................................................................... 662 Weiterführende Literatur.................................................................................... 668 35 673 Sven Hoffmann 35.1 Regulatorischer Hintergrund................................................................. 673 35.2 Inhaltliche Einführung und Diskussion................................................. 675 35.3 Sinn und Zweck einer Zertifizierung..................................................... 702 Weiterführende Literatur.................................................................................... 703 36 Klinische Studien für die In-vitro-Diagnostik................................................. Jörg-Michael Hollidt 36.1 Gesetzliche Grundlagen........................................................................ 36.2 Humane Bioproben für die diagnostische Forschung, Entwicklung und Zulassung..................................................... 711 Literatur.............................................................................................................. 705 Dokumentation in klinischen Prüfungen.......................................................... 725 Dietmar Rescheleit und Gabriele Hartwig 37.1 Trial Master
File.................................................................................... 37.2 Sponsor, CRO, Prüfer - Verantwortung und Aufgaben........................ 725 727 37 Die neue EU-Verordnung 2017/746 über In-vitro-Diagnostika................... ISO 13485 - das obligatorische Qualitätssystem für IVD-Hersteller......... 707 722
XXVI 38 Inhaltsverzeichnis 37.3 TMF-Setup und-Struktur........................................................................... 37.4 Elektronischer TMF, Papier-TMF, Hybride.............................................. 37.5 eTMF-Systeme............................................................................................ 37.6 Management von Dokumenten im eTMF................................................ 37.7 Archivierung der Studienunterlagen im TMF bzw. eTMF....................... Literatur.................................................................................................................... 728 729 730 731 733 735 Patentschutz für diagnostische Verfahren und seine Grenzen...................... 737 Joseph Straus 38.1 In-Vitro-Diagnostik - wirtschaftliche und regulatorische Aspekte .... 38.2 Patentschutz und In-Vitro-Diagnostik..................................................... 38.3 Umfang des Schutzes der in IVD integrierten Diagnostizierverfahren... 38.4 Rechtsfragen im Zusammenhang mit der BGH-Entscheidung Rezeptortyrosinkinase II und ihre Folgen................................. 749 38.5 Abschließende Bemerkungen.................................................................... 39 737 740 744 752 Lernende Laborsysteme: Wie kann künstliche Intelligenz im Labor unterstützen?..................................................................................................... 755 Matthieu-P. Schapranow 39.1 Netzwerke für den grenzübergreifenden Austausch................................ 756 39.2 Künstliche Intelligenz: Der Traum von intelligenten
Algorithmen .... 757 39.3 Lernende Systeme..................................................................................... 758 39.4 Training von Kl-Verfahren: Eine neue Form der Programmierung .... 759 39.5 Entwicklung von lernenden Systemen: Ein iterativer Prozess............... 760 39.6 Zugang zu aktuellen Realdaten................................................................ 763 39.7 Labore: Quellen der Daten früher wie heute........................................... 764 39.8 Lernende Systeme im Labor...................................................................... 765 39.9 Worauf ist bei der Entwicklung von lernenden Systemen zu achten?. .. 765 39.10 Angriffe auf lernende Systeme im Labor................................................. 766 39.11 Schutz von Missbrauch............................................................................ 766 39.12 Nachvollziehbarkeit von Prognosen lernender Systeme........................ 767 39.13 Föderierte Lernverfahren.......................................................................... 768 39.14 Fallbeispiel I: Lernende Systeme bei der Therapieauswahl................... 768 39.15 Fallbeispiel II: Lernende Systeme bei der Wirkstoffentwicklung......... 770 39.16 Fallbeispiel III: Lernende Systeme beichronischen Erkrankungen. . .. 770 39.17 Fallbeispiel IV: Lernende Systeme helfen bei der Analyse der COVID-19-Lage........................................................................... 772 39.18 Ausblick...................................................................................................... 772
Literatur.................................................................................................................... 775 Stichwortverzeichnis.......................................................................................................... 777
Immunoassays Dieses Methodenbuch vermittelt eine gut lesbare, fundierte Einführung in die Grund prinzipien immunologischer Methoden. Wissenschaftlerinnen der Naturwissenschaf ten und Medizin wie auch TAs können sich einen ersten, grundlegenden Einblick in die Durchführung der verschiedenen Immunoassays verschaffen und werden dabei über deren unterschiedliche Einsatzbereiche informiert. Jedes Kapitel in Immuno assays beginnt mit einer grundlegenden Einführung in die Thematik, bevor auch für den Laboralltag und die berufliche Praxis wichtige Details abgehandelt werden. Die Leserinnen erlangen mit dieser Lektüre Sicherheit beim Einsatz der Methoden im Laboralltag, da auftretende Probleme und was man dagegen tun kann im Detail besprochen werden. Hierbei sind die zahlreichen Tipps aus der Praxis sehr wertvoll. Besonders hervorzuheben in diesem Buch sind die akkuraten und funktionierenden Rezepte. Durch ihre tagtägliche Arbeit mit Immunoassays verfügen die Autorinnen wie auch die Herausgeber über einen reichen Erfahrungsschatz mit diesen Methoden. Eine rundum hilfreiche Lektüre für Einsteigerinnen und erfahrene Praktikerinnen. Die Herausgeber Dr. Arnold Maria Raem ist am Zentrum für Nanotechnologie der Westfalischen Wilhelms Universität im Bereich der molekularen Biomedizin / Onkologie tätig. Dr. Peter Rauch ist Geschäftsführer der Candor Bioscience GmbH, einem Biotechno logie-Unternehmen, welches sich mit der Forschung und Entwicklung von Immuno assays befasst. Die Autorinnen sind ausgewiesene Experten in ihrem Themenfeld, sie kommen aus den Bereichen Universität,
Forschungsinstitute sowie der Industrie.
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Inhaltsverzeichnis 1 2 3 Einführung in Immunoassays. Arnold Maria Raem, Claudia Goldman, Fabio Rizzo, Uwe Schedler, Fridtjof Lechhart und Enrico Pelz 1.1 Biologische Grundlagen der Immunoassays. 1.2 Die adaptive Immunabwehr. 1.3 Struktur und biologische Funktion der Antikörper. 1.4 Antikörper in der Analytik. 1.5 Immunoassays - die Qual der Wahl. Antikörper. Rudolf Gruber 2.1 Struktur und Funktion. 2.2 Affinität, Avidität und KD-Wert. 2.3 Immunisierung. 2.4 Monoklonale Antikörper. 2.5 Humane monoklonale Antikörper, rekombinante, gentechnisch hergestellte Antikörper und Varianten. 2.6 Produktion. 2.7 Aufreinigung/Extraktion. 2.8
Konjugation. 2.9 Ende gut, Alles gut. Weiterführende Literatur. ELISA/EIA/FIA. Göran Key 3.1 Historisches. 3.2 ELISA-Sy steme. 3.3 Bindung an die Oberfläche. 3.4 Kopplung des Markerenzyms/Signalverstärkung. 3.5 Einsatz von Antikörperfragmenten. 3.6 Etablierung und Durchführung von ELISAs. 1 2 4 6 8 11 21 22 32 34 37 39 42 44 48 51 51 53 53 54 56 58 59 59 XVII
XVIII 4 5 Inhaltsverzeichnis 3.7 Fluoreszenzimmunoassay. 3.8 Rezepte. Weiterführende Literatur. 68 69 70 Probenvorbereitung für Immunoassays. 73 Verena Blättel-Born und Peter Sander 4.1 Probenaufarbeitung. 4.2 Die qualitative Bestimmung am Beispiel der Infektionsdiagnostik. . 4.3 Die quantitative Bestimmung am Beispiel der Darmkrebsvorsorge . Weiterführende Literatur. 73 76 79 82 Lateral-Flow-Immunoassays. 83 Matthias Lehmann 5.1 Lateral-Flow-Immunoassays - wie alles begann. 5.2 Grundprinzip und Assayformate. 5.3 Produktentwicklung und regulatorische Anforderungen - ein Überblick. 89 5.4 Antikörper - der Schlüssel für einen robusten Assay. 5.5 Label und Konjugat. 5.6 Nichtbiologische
Assaykomponenten. 5.7 Assayoptimierung - die nächsten Schritte. 5.8 Interpretation der Ergebnisse. 5.9 Lateral-Flow-Immunoassay-Markt. 5.10 Fazit. Literatur. 6 Immuno-PCR: Anwendungsorientierte hochsensitive ProteinAnalytik mit Antikörper-DNA-Konjugaten. 95 98 101 107 109 113 115 116 119 Michael Adler 6.1 Was ist Immuno-PCR?. 6.2 Wie funktioniert Immuno-PCR?. 6.3 Anwendungsbeispiel undpraktische Überlegungen zum Assayeinsatz: Cytokin IL-6. 6.4 Ausblick. Literatur. 7 83 85 Evolution der PCR - von der klassischen PCR zur digitalen PCR. Patrick Gürtler und Sven Pecoraro 7.1 Evolution der Polymerasekettenreaktion.
7.2 Digitale PCR. 7.3 Unterschiede der digitalen PCR zur konventionellen PCR und Real-time PCR. 160 Literatur. 119 122 128 137 138 141 141 153 161
XIX Inhaltsverzeichnis 8 9 Die Detektion von Proteinen auf Membranen: Western-Blot- und Dot-Blot-Verfahren. 165 Thorsten Kuczius 8.1 Das Western-Blot-Verfahren. 8.2 Das Dot-Blot-Verfahren. Literatur. 165 169 174 Beschleunigung des Western-Blotting. Sabine Glöggler und Carina Vogt 177 9.1 Beschleunigung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). 9.2 Beschleunigung des Blottens. 9.3 Beschleunigung der Immundetektion. 9.4 Die Ein-Schritt-Reaktion. 9.5 Markierung des Primärantikörpers. 9.6 Multiplex-Assays. 9.7 Verwendung von alternativen Geräten. Weiterführende Literatur. 177 179 180 180 183 184 185 186 10
Proteinarrays. Johanna Sonntag und Matthias Griessner 189 10.1 Proteinarray-Formate. 10.2 Oberflächenfunktionalisierung. 10.3 Layout von Proteinarrays. 10.4 Detektionsverfahren und Auswertung. 10.5 Anwendungen in Forschung undDiagnostik. Literatur. 190 197 199 201 204 208 Lab-on-a-Chip - Miniaturisierung von Assays für vor-Ortdiagnostische Anwendungen mittels Mikrofluidik. 211 Jörg Nestler, Jenny Frank und Frank Bier 11.1 Mikrofluidik. 11.2 Materialien und Herstellungstechnologien für Chiplabore. 11.3 Reagenzien-Vorlagerung. 11.4 Detektion des Analyten ֊ Biosensoren. 11.5 Mikro-Makro-Schnittstelle und Probenvorbereitung. 11.6 Anwendungsgebiete.
Literatur. 212 218 220 222 226 228 229 Zuverlässige Proteinquantifizierung durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. 231 11 12 Patrick Opdensteinen und Johannes F. Buyel 12.1 Prinzipien der SPR-Spektroskopie zur Quantifizierung spezifischer Proteine. 232
Inhaltsverzeichnis XX Verwendung von SPR zur Proteinquantifizierung und Bindungsanalyse. 234 12.3 Quantifizierung von Proteintargets mittels spezifisch funktionalisierter Oberflächen. 235 12.4 Multiplex-Probenvorbereitung mit minimalem Aufwand. 12.5 Reproduzierbare Zielquantifizierung durch SPR auch ohne Standards. 239 12.6 Assayeinschränkungen und Fehlerbehebung. 12.7 Schlussfolgerung. Literatur. 12.2 13 14 16 246 248 248 Grundlagen moderner Methoden in der Durchflusszytometrie. 251 Malte Paulsen, Diana Rueda-Ordonez und Michelle Paulsen 13.1 TechnischeVoraussetzungen für hochparametrische Durchflusszytometrie. 251 13.2 Tipps für experimentelles Design von hochparametrischen Assays . 13.3 Analyseansätze für hochparametrische Durchflusszytometrie. 13.4 Zytometrie in der Ära der Genomik. Literatur. 268 274 280 284 Nachweismethoden zur Protein-
Interaktion. 285 Tobias Pusterla und Ann-Cathrin Volz 14.1 Zeitaufgelöste Fluoreszenz. 14.2 Alpha-Technologie. 14.3 Ratiometrische Messungen zur Untersuchung der ProteinProtein-Interaktion . 14.4 Fluoreszenzpolarisation . 14.5 Zusammenfassung. Literatur. 15 237 286 293 300 311 312 314 Immunhistochemie für Forschung und diagnostische Pathologie. 317 Igor B. Buchwalow, Werner Böcker und Markus Tiemann 15.1 Fixierung. 15.2 Antigendemaskierungstechniken. 15.3 Signalamplifikation (Signalverstärkung). 15.4 Multiple Immunfluoreszenzmarkierung. 15.5 Multiple Immunenzymmarkierung. 15.6 Hintergrundfärbung und Blockierungsschritte.
Literatur. 318 319 320 323 328 332 334 Fluoreszenzmikroskopie in der Immunoassayanwendung - eine Einführung. 339 Klaus Nettesheim 16.1 Was ist Fluoreszenz?. 340
Inhaltsverzeichnis XXI Prinzip und Auftau eines Fluoreszenzmikroskops. Aufbau eines Filterwürfels/Filterblocks. Lichtquellen für die Fluoreszenzmikroskopie. Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops . Anwendungen für die Fluoreszenzmikroskopie. Grenzen der Fluoreszenzmikroskopie . 343 343 346 347 349 349 17 In-vivo-Immunfärbung und intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie . Marco Gallus und Maria Gabriele Bixel 17.1 Zwei-Photonen-Mikroskopie. 17.2 Zwei-Photonen-Absorption ֊ Fluorophore, Autofluoreszenz und SHG/THG. 354 17.3 Intravitale Anwendungen der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Literatur. 351 16.2 16.3 16.4 16.5 16.6 16.7 18 19 Quantitative digitalholografische Phasenkontrastmikroskopie biophysikalische Charakterisierung von immunologischen Prozessen, Zellen und Geweben. 369 Björn Kemper, Thomas Liedtke und Jürgen Schnekenburger 18.1 Quantitative digitalholografische Phasenkontrastmikroskopie . 18.2 Zellidentifizierung und
Zellkulturqualitätskontrolle. 18.3 Markerfireie In-vitro-Toxizitätsanalyse am Beispiel von Makrophagen. 18.4 Quantifizierung von Entzündung im Gewebe. Literatur. Zirkulierende Tumorzellen - Isolation und molekulare Charakterisierung. 379 Caroline Werner und Gabriele Multhoff 19.1 Methoden der Isolation von CTCs. 19.2 СТС-Isolierung mittels S-pluriBeads®. 19.3 Identifizierung von CTCs über immunzytochemische Färbung. Literatur. 20 Automatisierte Isolation zirkulierender Tumorzellen für die Liquid Biopsy. 389 Sabine Alebrand, Christian Freese, Janis Stiefel, Arnold Maria Raem und Michael Baßler 20.1 Die Liquid Biopsy als Zukunftstechnologie in der Diagnostik. 20.2 CTCs als Biomarker: Ziele und Herausforderungen. 20.3 Methoden der Anreicherung seltener Zellen aus Vollblut. 20.4 Vereinzelung von
CTCs. 20.5 Automatisierung der Anreicherung, Identifikation und Vereinzelung von CTCs. 399 351 357 367 370 372 373 376 378 380 383 386 386 389 393 393 397
Inhaltsverzeichnis XXII Das CTCelect-System: Technologie zur vollautomatisierten Isolation zirkulierender Tumorzellen aus Vollblut. 404 20.7 Der Weg zur personalisierten Medizin. Literatur. 408 409 3D-Zell-und Organoidkultur. 411 Kevin Achberger, Lena Antkowiak und Stefan Liebau 21.1 Die Möglichkeiten der 3D-Kulturverfahren. 21.2 Organoide. 21.3 Vom Organoid zum Organ. 21.4 Zusammenfassung. Literatur. 412 414 429 433 433 Tissue Engineering und Regenerative Medizin. 435 Valentin Kerkfeld und Ulrich Meyer 22.1 Angeborene Immunität. 22.2 Adaptive Immunität. Literatur. 439 441 444 20.6 21 22
23 24 25 Die CRISPR/Cas-Technologie: Klassische und zukünftige Anwendungen in der Molekularbiologie und Medizin. 447 Claudia Rutz und Ralf Schülein 23.1 Einleitung: Der Ursprung von CRISPR/Cas - vom bakteriellen Immunsystem zur universellenGenmodifizierungsmethode. 447 23.2 Die Anwendungen von CRISPR/Cas. 23.3 CRISPR/Cas: Die Praxis. 23.4 Schlussbemerkungen. Weiterführende Literatur. 450 459 462 462 Fluoreszenzfarbstoffe. 465 Lutz Haalck 24.1 Kleine Farbenlehre. 24.2 Charakterisierung von Fluoreszenzfarbstoffen. 24.3 Instrumentelle Voraussetzungen. 24.4 Neuere Entwicklungenin der Fluoreszenzmikroskopie. 24.5 Praktischer Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen. 24.6 Herstellung von Antikörper-Fluorophor-Konjugaten. Weiterführende Literatur. 468 469 471 474 475 477 484 Oberflächen und
Immobilisierung. 487 Peter Esser, Thomas Andersen und Vibeke Rowell 25.1 Prinzipien der passiven Adsorption an Polystyrol. 25.2 Die Wahl der richtigen Oberfläche. 487 496
Inhaltsverzeichnis Oberflächen für kovalente Bindung. Immobilisierung von DNA. 499 504 Stabilisierung von Assaykomponenten. 507 Angela Zellmer, Manuel Hecht und Peter Rauch 26.1 Stabilisierung immobilisierter Fängerantikörper. 26.2 Stabilisierung der Standards und Kontrollen. 26.3 Stabilisierung der Detektorantikörper. Weiterführende Literatur. 508 513 515 519 25.3 25.4 26 27 28 Störeffekte bei Immunoassays. Peter Rauch und Tobias Polifke 27.1 StörungendurchOberflächeneffekte . 27.2 Störungen durch Immunoassay-Label. 27.3 Störungen durch Assayantikörper. 27.4 Störungen durch Kreuzreaktionen und unspezifische Bindungen. 27.5 Der High-Dose-Hook-Effekt. 27.6 Vermeidung von Störeffekten. Weiterführende Literatur. 521 522 524 525 532 534 534 537
Troubleshooting und Hilfestellungen bei der Entwicklung, Validierung und Durchführung von ELISAs. 539 Peter Schneider und Anna Funk 28.1 Das ELISA-Test-Format. 28.2 Schlüsselreagenzien und Hilfsreagenzien. 28.3 Die Bedeutung der Antikörperqualität. 28.4 Herstellung eigener Antikörper. 28.5 Haptenkonjugate mit Enzymen und Trägerproteinen sowie Haptenmodifikationen. 28.6 Kriterien zur Einstellung von ELISA-Tests. 28.7 Einfluss spezieller Puffersysteme. 28.8 Beschichtung und Stabilisierung der beschichteten Oberflächen von Mikrotiterplatten. 28.9 Probenmatrix und Probenvorbereitung. 28.10 Häufige Fehler und deren mögliche Ursachen. 28.11 Weitere Interferenzen insbesondere bei der Bestimmung klinischer Proben. 552 28.12 Zusammenfassung.
Literatur. 29 XXIII 540 541 542 543 544 546 548 550 551 552 554 555 Auswertung und Validierung. 557 Tobias Polifke und Peter Rauch 29.1 Ausreißertests. 29.2 Validierung von Immunoassays. 558 560
Inhaltsverzeichnis XXIV 30 29.3 Fazit. Literatur. 570 571 Lebensmittel- und Futtermittelanalytik. 573 Markus Laconi und Thomas Hektor 30.1 Probenahme. 30.2 Probenaufarbeitung. 30.3 Kalibration. 30.4 Ermittlung von Leistungsdaten: Validierung von Immunoassays in der Lebensmittelanalytik. 30.5 Bewertung eines Ergebnisses. 30.6 Grenzen eines Messsystems. Weiterführende Literatur. 31 32 33 576 577 579 581 589 591 592 Automatisierung von Immunoassays. 593 Matthias Herkert und Nikolas Vogel 31.1 Problemfelder bei der Automatisierung. 31.2 Zusammenfassung. Weiterführende
Literatur. 594 606 607 Präanalytische Qualitätssicherung durchzuverlässige Probenstabilisierung und -logistik. 609 Kateryna Shreder, Ullrich Stahlschmidt und Georg Klopfer 32.1 Stabilisierung von zellfreier DNA (cfDNA). 32.2 Stabilisierung von zirkulierenden Tumorzellen. 32.3 Stabilisierung von zellfreier RNA (cfRNA). 32.4 Stabilisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs). Literatur. 610 612 613 614 614 Herausforderungen für ein Next Generation Biobanking Kryokonservierung für die Weiterentwicklung der personalisierten Medizin. 617 Christian Stephan, Günther Winde, Enrico Pelz und Arnold Maria Raem 33.1 Was ist eine Biobank - Definition und Funktion. 33.2 Welche Bedeutung haben Biobanken in der modernen Medizin?. 33.3 Was sind aktuell limitierende Faktoren des Biobankings?. 33.4 Voll automatisierte Kryokonservierung durch UltratiefkühlLagerung?. 630 33.5 Was sind wichtige Elemente für eine modern funktionierende
Biobank?. 632 33.6 Ausblick. Literatur. 617 619 623 634 635
Inhaltsverzeichnis XXV 34 637 Volker Franzen und Thomas Klütz 34.1 Was sind In-vitro-Diagnostika? . 638 34.2 Der neue Rechtsrahmen. 638 34.3 Zweckbestimmung. 644 34.4 Klassifizierungsregeln . 645 34.5 Konformitätsbewertung. 646 34.6 Von den Benannten Stellen zu erfüllende Anforderungen. 649 34.7 Allgemeine Sicherheits- und Leistungsanforderungen. 650 34.8 Technische Dokumentation. 653 34.9 Das neue Konzept der Leistungsbewertung. 654 34.10 Harmonisierte Normen, gemeinsame Spezifikationen und Stand der Technik. 658 34.11 Das neue europäische elektronische Informationssystem für Medizinprodukte. 658 34.12 System für die Überwachung nach dem Inverkehrbringen. 659 34.13 Vigilanz. 660 34.14 Für die Einhaltung der RegulierungsVorschriften verantwortliche
Person. 660 34.15 Produkte zur Eigenherstellung in Gesundheitseinrichtungen. 661 34.16 Grafische Übersicht über die Anforderungen der IVD-VO. 661 34.17 Fazit. 662 Weiterführende Literatur. 668 35 673 Sven Hoffmann 35.1 Regulatorischer Hintergrund. 673 35.2 Inhaltliche Einführung und Diskussion. 675 35.3 Sinn und Zweck einer Zertifizierung. 702 Weiterführende Literatur. 703 36 Klinische Studien für die In-vitro-Diagnostik. Jörg-Michael Hollidt 36.1 Gesetzliche Grundlagen. 36.2 Humane Bioproben für die diagnostische Forschung, Entwicklung und Zulassung. 711 Literatur. 705 Dokumentation in klinischen Prüfungen. 725 Dietmar Rescheleit und Gabriele Hartwig 37.1 Trial Master
File. 37.2 Sponsor, CRO, Prüfer - Verantwortung und Aufgaben. 725 727 37 Die neue EU-Verordnung 2017/746 über In-vitro-Diagnostika. ISO 13485 - das obligatorische Qualitätssystem für IVD-Hersteller. 707 722
XXVI 38 Inhaltsverzeichnis 37.3 TMF-Setup und-Struktur. 37.4 Elektronischer TMF, Papier-TMF, Hybride. 37.5 eTMF-Systeme. 37.6 Management von Dokumenten im eTMF. 37.7 Archivierung der Studienunterlagen im TMF bzw. eTMF. Literatur. 728 729 730 731 733 735 Patentschutz für diagnostische Verfahren und seine Grenzen. 737 Joseph Straus 38.1 In-Vitro-Diagnostik - wirtschaftliche und regulatorische Aspekte . 38.2 Patentschutz und In-Vitro-Diagnostik. 38.3 Umfang des Schutzes der in IVD integrierten Diagnostizierverfahren. 38.4 Rechtsfragen im Zusammenhang mit der BGH-Entscheidung Rezeptortyrosinkinase II und ihre Folgen. 749 38.5 Abschließende Bemerkungen. 39 737 740 744 752 Lernende Laborsysteme: Wie kann künstliche Intelligenz im Labor unterstützen?. 755 Matthieu-P. Schapranow 39.1 Netzwerke für den grenzübergreifenden Austausch. 756 39.2 Künstliche Intelligenz: Der Traum von intelligenten
Algorithmen . 757 39.3 Lernende Systeme. 758 39.4 Training von Kl-Verfahren: Eine neue Form der Programmierung . 759 39.5 Entwicklung von lernenden Systemen: Ein iterativer Prozess. 760 39.6 Zugang zu aktuellen Realdaten. 763 39.7 Labore: Quellen der Daten früher wie heute. 764 39.8 Lernende Systeme im Labor. 765 39.9 Worauf ist bei der Entwicklung von lernenden Systemen zu achten?. . 765 39.10 Angriffe auf lernende Systeme im Labor. 766 39.11 Schutz von Missbrauch. 766 39.12 Nachvollziehbarkeit von Prognosen lernender Systeme. 767 39.13 Föderierte Lernverfahren. 768 39.14 Fallbeispiel I: Lernende Systeme bei der Therapieauswahl. 768 39.15 Fallbeispiel II: Lernende Systeme bei der Wirkstoffentwicklung. 770 39.16 Fallbeispiel III: Lernende Systeme beichronischen Erkrankungen. . . 770 39.17 Fallbeispiel IV: Lernende Systeme helfen bei der Analyse der COVID-19-Lage. 772 39.18 Ausblick. 772
Literatur. 775 Stichwortverzeichnis. 777
Immunoassays Dieses Methodenbuch vermittelt eine gut lesbare, fundierte Einführung in die Grund prinzipien immunologischer Methoden. Wissenschaftlerinnen der Naturwissenschaf ten und Medizin wie auch TAs können sich einen ersten, grundlegenden Einblick in die Durchführung der verschiedenen Immunoassays verschaffen und werden dabei über deren unterschiedliche Einsatzbereiche informiert. Jedes Kapitel in Immuno assays beginnt mit einer grundlegenden Einführung in die Thematik, bevor auch für den Laboralltag und die berufliche Praxis wichtige Details abgehandelt werden. Die Leserinnen erlangen mit dieser Lektüre Sicherheit beim Einsatz der Methoden im Laboralltag, da auftretende Probleme und was man dagegen tun kann im Detail besprochen werden. Hierbei sind die zahlreichen Tipps aus der Praxis sehr wertvoll. Besonders hervorzuheben in diesem Buch sind die akkuraten und funktionierenden Rezepte. Durch ihre tagtägliche Arbeit mit Immunoassays verfügen die Autorinnen wie auch die Herausgeber über einen reichen Erfahrungsschatz mit diesen Methoden. Eine rundum hilfreiche Lektüre für Einsteigerinnen und erfahrene Praktikerinnen. Die Herausgeber Dr. Arnold Maria Raem ist am Zentrum für Nanotechnologie der Westfalischen Wilhelms Universität im Bereich der molekularen Biomedizin / Onkologie tätig. Dr. Peter Rauch ist Geschäftsführer der Candor Bioscience GmbH, einem Biotechno logie-Unternehmen, welches sich mit der Forschung und Entwicklung von Immuno assays befasst. Die Autorinnen sind ausgewiesene Experten in ihrem Themenfeld, sie kommen aus den Bereichen Universität,
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