Verfügbarkeit: Bioanalytik :: THWS Bibkatalog

Bioanalytik:

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Bibliographische Detailangaben
Vorheriger Titel:	Lottspeich, Friedrich Bioanalytik
Weitere Verfasser:	Kurreck, Jens 1969- (HerausgeberIn), Engels, Joachim W. 1944-2018 (HerausgeberIn), Lottspeich, Friedrich 1947- (HerausgeberIn)
Format:	Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Berlin Springer Spektrum [2022]
Ausgabe:	4. Auflage
Schlagworte:	Biochemische Analyse
Online-Zugang:	Inhaltstext Buchcover Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	XXXIV, 1183 Seiten Illustrationen, Diagramme 29 cm
ISBN:	9783662617069

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MARC


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adam_text	XI INHALTSVERZEICHNIS 1 BIOANALYTIK-EINE EIGENSTAENDIGE WISSENSCHAFT ................................................. 1 JENS KURRECK, FRIEDRICH LOTTSPEICH UND JOACHIM W. ENGELS 1.1 PARADIGMENWECHSEL IN DER BIOCHEMIE: VON DER PROTEINCHEMIE ZUR SYSTEMBIOLOGIE ........ 3 1.1.1 KLASSISCHE STRATEGIE .............................................................................................................. 3 1.1.2 HOLISTISCHE STRATEGIE ............................................................................................................ 3 1.2 METHODEN BEGRUENDEN FORTSCHRITT ...................................................................................... 4 1.2.1 PROTEINANALYTIK ..................................................................................................................... 6 1.2.2 MOLEKULARBIOLOGIE ................................................................................................................ 7 1.2.3 BIOINFORMATIK ........................................................................................................................ 9 1.2.4 FUNKTIONSANALYSE .................................................................................................................. 9 1 PROTEINANALYTIK 2 PROTEINREINIGUNG ...................................................................................................... 13 FRIEDRICH LOTTSPEICH 2.1 EIGENSCHAFTEN VON PROTEINEN .............................................................................................. 14 2.2 PROTEINLOKALISATION UND REINIGUNGSSTRATEGIE .................................................................... 17 2.3 HOMOGENISIERUNG UND ZELLAUFSCHLUSS.............................................................................. 18 2.4 DIE FAELLUNG.......................................................................................................................... 20 2.5 ZENTRIFUGATION ..................................................................................................................... 21 2.5.1 GRUNDLAGEN .......................................................................................................................... 22 2.5.2 ZENTRIFUGATIONSTECHNIKEN ..................................................................................................... 23 2.6 ABTRENNUNG VON SALZEN ODER HYDROPHILEN VERUNREINIGUNGEN ......................................... 25 2.7 KONZENTRIERUNG .................................................................................................................. 27 2.8 DETERGENZIEN UND IHRE ENTFERNUNG ................................................................................... 28 2.8.1 EIGENSCHAFTEN VON DETERGENZIEN ......................................................................................... 28 2.8.2 ENTFERNEN VON DETERGENZIEN ................................................................................................ 31 2.9 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE PROTEOMANALYSE .................................................................... 32 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 32 3 PROTEINBESTIMMUNGEN ........................................................................................... 33 LUTZ FISCHER 3.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DURCH FAERBETESTS ...................................................................... 35 3.1.1 BIURET-ASSAY .......................................................................................................................... 37 3.1.2 LOWRY-ASSAY .......................................................................................................................... 37 3.1.3 BICINCHONINSAEURE-ASSAY (BCA-ASSAY) ................................................................................... 38 3.1.4 BRADFORD-ASSAY ..................................................................................................................... 38 3.2 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN .............................................................................................. 39 3.2.1 MESSUNGEN IM UV-BEREICH................................................................................................... 39 3.2.2 FLUORESZENZMETHODE ........................................................................................................... 41 3.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PEPTIDEN UND PROTEINEN ...................................................... 41 3.3.1 LODIERUNGEN ......................................................................................................................... 42 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 44 4 ENZYMATISCHE AKTIVITAETSTESTS ............................................................................... 45 HANS BISSWANGER 4.1 MICHAELIS-MENTEN-GLEICHUNG ........................................................................................... 46 4.2 KRITERIEN FUER DIE KONZENTRATIONEN DER TESTSUBSTANZEN .................................................... 49 4.3 EINFLUESSE AUF DIE ENZYMAKTIVITAET........................................................................................ 49 4.3.1 PH-ABHAENGIGKEIT ................................................................................................................. 49 4.3.2 ABHAENGIGKEIT VON DER LONENSTAERKE ...................................................................................... 50 XII INHALTSVERZEICHNIS 4.3.3 ABHAENGIGKEIT VON DER TEMPERATUR ........................................................................................ 50 4.3.4 STABILITAET VON ENZYMEN ........................................................................................................ 51 4.4 AUFBAU EINES TESTSYSTEMS ................................................................................................... 52 4.4.1 GENERELLE VORGEHENSWEISE BEI ENZYMTESTS .......................................................................... 52 4.4.2 KONZIPIERUNG EINES SPEZIELLEN TESTVERFAHRENS...................................................................... 52 4.5 MESSTECHNIKEN .................................................................................................................... 54 4.5.1 OPTISCHE METHODEN ............................................................................................................. 54 4.5.2 ELEKTROCHEMISCHE METHODEN ................................................................................................ 55 4.5.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG ....................................................................................................... 56 4.5.4 CHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN ........................................................................................... 56 4.5.5 DIVERSE METHODEN ................................................................................................................. 56 5 MIKROKALORIMETRIE ................................................................................................... 59 ALFRED BLUME 5.1 DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (DSC) ........................................................................... 61 5.2 ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY (ITC) ............................................................................... 67 5.2.1 BINDUNG VON LIGANDEN AN PROTEINE ...................................................................................... 67 5.2.2 BINDUNG VON MOLEKUELEN AN MEMBRANEN: EINBAU UND PERIPHERE BINDUNG .......................... T2 5.3 PRESSURE PERTURBATION CALORIMETRY (PPC) ............................................................................ 75 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 76 6 IMMUNOLOGISCHE TECHNIKEN ................................................................................... 77 HYUN-DONG CHANG UND REINHOLD PAUL LINKE 6.1 ANTIKOERPER ........................................................................................................................... 78 6.1.1 ANTIKOERPER UND IMMUNABWEHR ............................................................................................. 78 6.1.2 ANTIKOERPER ALS REAGENS ........................................................................................................ 78 6.1.3 EIGENSCHAFTEN VON ANTIKOERPERN ........................................................................................... 79 6.1.4 FUNKTIONELLE STRUKTUR VON IGG ............................................................................................... 81 6.1.5 ANTIGENBINDUNGSSTELLE (HAFTSTELLE) ....................................................................................... 82 6.1.6 HANDHABUNG VON ANTIKOERPERN ............................................................................................. 83 6.2 ANTIGENE ............................................................................................................................... 84 6.3 ANTIGEN-ANTIKOERPER-REAKTION ............................................................................................ 85 6.3.1 IMMUNAGGLUTINATION ............................................................................................................ 86 6.3.2 IMMUNPRAEZIPITATION ............................................................................................................. 87 6.3.3 IMMUNBINDUNG .................................................................................................................... 97 6.4 KOMPLEMENTFIXATION ............................................................................................................ 106 6.5 METHODEN DER ZELLULAEREN IMMUNOLOGIE ............................................................................. 106 6.5.1 IMMUNHISTOCHEMIE, IMMUNCYTOCHEMIE .............................................................................. 106 6.5.2 DURCHFLUSSCYTOMETRIE ............................................................................................................ 108 6.5.3 SERIELLES ZELLSORTIERVERFAHREN ................................................................................................ 111 6.5.4 PARALLELE ZELLSORTIERVERFAHREN ............................................................................................... 111 6.6 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN .............................................................................................. 112 6.6.1 ARTEN VON ANTIKOERPERN ........................................................................................................... 112 6.6.2 AUSBLICK: KUENFTIGE ERWEITERUNG DER BINDUNGSKONZEPTE ....................................................... 114 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 115 7 CHEMISCHE MODIFIKATION VON PROTEINEN UND PROTEINKOMPLEXEN ................... 117 SYLVIA ELS-HEINDL, ANETTE KAISER, KATHRIN BELLMANN-SICKERT UND ANNETTE G BECK-SICKINGER 7.1 CHEMISCHE MODIFIKATION FUNKTIONELLER GRUPPEN VON PROTEINEN ...................................... 119 7.1.1 LYSINRESTE .............................................................................................................................. 119 7.1.2 CYSTEINRESTE .......................................................................................................................... 122 7.1.3 GLUTAMAT-UND ASPARTATRESTE ................................................................................................ 123 7.1.4 ARGININRESTE .......................................................................................................................... 124 7.1.5 TYROSINRESTE .......................................................................................................................... 124 7.1.6 TRYPTOPHANRESTE .................................................................................................................... 125 INHALTSVERZEICHNIS XIII 7.1.7 METHIONINRESTE ..................................................................................................................... 126 7.1.8 HISTIDINRESTE ......................................................................................................................... 126 7.2 MODIFIZIERUNG ALS MITTEL ZUR EINFUEHRUNG VON REPORTERGRUPPEN ........................................ 127 7.2.1 UNTERSUCHUNGEN AN NATUERLICH VORKOMMENDEN PROTEINEN .................................................. 127 7.2.2 UNTERSUCHUNGEN AN MUTIERTEN PROTEINEN ............................................................................ 130 7.3 PROTEIN-CROSSLINKING ZUR ANALYSE VON PROTEINWECHSELWIRKUNGEN ..................................... 132 7.3.1 BIFUNKTIONELLE REAGENZIEN ................................................................................................... 133 7.3.2 PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG ................................................................................................... 133 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 143 8 SPEKTROSKOPIE .......................................................................................................... 145 WERNER MAENTELE 8.1 PHYSIKALISCHE PRINZIPIEN UND MESSTECHNIKEN .................................................................... 147 8.1.1 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN OPTISCHER SPEKTROSKOPISCHER MESSMETHODEN ............................ 147 8.1.2 WECHSELWIRKUNG LICHT-MATERIE ............................................................................................ 148 8.1.3 ABSORPTIONSMESSUNGEN ...................................................................................................... 156 8.1.4 PHOTOMETER .......................................................................................................................... 159 8.1.5 KINETISCHE SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN .................................................................... 160 8.2 UV/VIS/NIR-SPEKTROSKOPIE .................................................................................................. 162 8.2.1 GRUNDLAGEN .......................................................................................................................... 162 8.2.2 CHROMOPROTEINE ................................................................................................................... 162 8.3 IR-SPEKTROSKOPIE ................................................................................................................. 168 8.3.1 GRUNDLAGEN .......................................................................................................................... 168 8.3.2 MOLEKUELSCHWINGUNGEN ........................................................................................................ 170 8.3.3 MESSTECHNIKEN ..................................................................................................................... 171 8.3.4 INFRAROTSPEKTROSKOPIE VON PROTEINEN ................................................................................... 174 8.4 RAMAN-SPEKTROSKOPIE........................................................................................................ 177 8.4.1 GRUNDLAGEN .......................................................................................................................... 177 8.4.2 RAMAN-EXPERIMENTE............................................................................................................. 178 8.4.3 RESONANZ-RAMAN-SPEKTROSKOPIE ......................................................................................... 178 8.5 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE ................................................................................................. 180 8.5.1 GRUNDLAGEN .......................................................................................................................... 180 8.5.2 FLUORESZENZSPEKTREN ALS EMISSIONSSPEKTREN UND ALS AKTIONSSPEKTREN ................................. 181 8.5.3 FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN MIT INTRINSISCHEN UND EXTRINSISCHEN FLUOROPHOREN ............... 182 8.5.4 SPEZIELLE FLUORESZENZTECHNIKEN: FRAP, FLIM, FCS.TIRF ......................................................... 184 8.5.5 FOERSTER-RESONANZ-ENERGIETRANSFER (FRET) ............................................................................ 185 8.5.6 EINZELMOLEKUELSPEKTROSKOPIE ................................................................................................ 185 8.6 METHODEN MIT POLARISIERTEM LICHT ..................................................................................... 186 8.6.1 LINEARDICHROISMUS ................................................................................................................ 186 8.6.2 OPTISCHE ROTATIONSDISPERSION UND CIRCULARDICHROISMUS ...................................................... 189 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 191 9 LICHTMIKROSKOPISCHE VERFAHREN - IMAGING ........................................................ 193 THOMAS QUAST UND WALDEMAR KOLANUS 9.1 WEGBEREITER DER MIKROSKOPIE - VON EINFACHEN LINSEN ZU HOCHAUFLOESENDEN MIKROSKOPEN ........................................................................................ 195 9.2 MODERNE ANWENDUNGSBEREICHE........................................................................................ 197 9.3 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN .................................................................................................. 197 9.3.1 PHAENOMENE DER BEUGUNG UND BILDENTSTEHUNG .................................................................. 201 9.4 NACHWEISMETHODEN ........................................................................................................... 202 9.4.1 HISTOLOGISCHE FAERBUNGEN .................................................................................................... 203 9.4.2 PHYSIKALISCHE FAERBUNGEN ...................................................................................................... 203 9.4.3 PHYSIKOCHEMISCHE VORGAENGE BEI FAERBUNGEN (ELEKTROADSORPTION) ....................................... 204 9.4.4 CHEMISCHE FAERBUNGEN ......................................................................................................... 204 9.4.5 FLUORESZENZMARKIERUNG ....................................................................................................... 204 9.4.6 DIREKTE UND INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG ......................................................... 204 XIV INHALTSVERZEICHNIS 9.4.7 IN VITRO-MARKIERUNG MIT ORGANISCHEN FLUOROCHROMEN ........................................................... 205 9.4.8 FLUORESZENZMARKIERUNG FUER LIVE CELL IMAGING ...................................................................... 205 9.4.9 IN V/VO-MARKIERUNG MIT ORGANISCHEN FLUOROCHROMEN ........................................................... 205 9.4.10 MARKIERUNG MIT QUANTUM DOTS ............................................................................................. 205 9.4.11 IN V/VO-MARKIERUNG MIT FLUORESZIERENDEN FUSIONSPROTEINEN (GFP UND VARIANTEN) .................. 206 9.4.12 FLUOROCHROME UND LICHTQUELLEN FUER DIE FLUORESZENZMIKROSKOPIE ........................................ 207 9.5 PRAEPARATIONSMETHODEN ....................................................................................................... 209 9.5.1 ISOLIERTE ZELLEN ...................................................................................................................... 209 9.5.2 GEWEBEBIOPSIEN .................................................................................................................. 210 9.5.3 PARAFFINPRAEPARATE .................................................................................................................. 210 9.5.4 GEFRIERSCHNITTE ...................................................................................................................... 211 9.6 SPEZIELLE FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE ANALYTIK ................................................................. 211 9.6.1 CLSM (CONFOCAL LASER SCANNING MICROSCOPY) ........................................................................ 211 9.6.2 MULTI-PHOTON FLUORESCENCE MICROSCOPY .............................................................................. 212 9.6.3 KONFOKALE HIGH-SPEED-SPINNING-DISK-SYSTEME (NIPKOW-SYSTEME) .................................... 214 9.6.4 LIVE CELL IMAGING .................................................................................................................. 214 9.6.5 LICHTMIKROSKOPISCHE SUPERAUFLOESUNG JENSEITS DES ABBE-LIMITS .......................................... 215 9.6.6 MESSUNG VON MOLEKUELBEWEGUNGEN ..................................................................................... 217 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 223 10 SPALTUNG VON PROTEINEN .......................................................................................... 225 JOSEF KELLERMANN 10.1 PROTEOLYTISCHE ENZYME ........................................................................................................ 226 10.2 STRATEGIE ............................................................................................................................... 227 10.3 DENATURIERUNG .................................................................................................................... 228 10.4 SPALTUNG VON DISULFIDBRUECKEN UND ALKYLIERUNG ............................................................... 228 10.5 ENZYMATISCHE FRAGMENTIERUNG ........................................................................................... 229 10.5.1 PROTEASEN .............................................................................................................................. 229 10.5.2 PROTEOLYSEBEDINGUNGEN ....................................................................................................... 234 10.6 CHEMISCHE FRAGMENTIERUNG................................................................................................ 235 10.7 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................. 236 LITERATUR ................................................................................................................................ 237 11 CHROMATOGRAPHISCHE TRENNMETHODEN FUER PEPTIDE UND PROTEINE .................. 239 REINHARD BOYSEN 11.1 INSTRUMENTIERUNG ............................................................................................................... 241 11.2 CHROMATOGRAPHISCHE THEORIE ........................................................................................... 242 11.3 DIE PHYSIKO-CHEMISCHEN CHARAKTERISTIKA DER PEPTIDE UND PROTEINE .............................. 245 11.4 CHROMATOGRAPHISCHE TRENNMETHODEN ............................................................................... 246 11.4.1 AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE ................................................................................................ 247 11.4.2 HOCHLEISTUNGS-REVERSED-PHASE-CHROMATOGRAPHIE (HP-RPC) .............................................. 248 11.4.3 HOCHLEISTUNGSNORMALPHASE-CHROMATOGRAPHIE (HP-NPC) .................................................... 249 11.4.4 HOCHLEISTUNGS-HYDROPHILE-INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE (HP-HILIC)................................. 250 11.4.5 HOCHLEISTUNGS-AQUEOUS-NORMALPHASECHROMATOGRAPHIE (HP-ANPC) ................................. 250 11.4.6 HOCHLEISTUNGS-HYDROPHOBE-INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE (HP-HIC) ................................. 251 11.4.7 HOCHLEISTUNGSIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE (HP-IEX) ................................................... 253 11.4.8 HOCHLEISTUNGSAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE (HP-AC) ................................................................ 254 11.5 METHODENENTWICKLUNG FUER DIE ANALYTISCHE CHROMATOGRAPHIE AM BEISPIEL DER HP-RPC. . 256 11.5.1 ENTWICKLUNG UND OPTIMIERUNG EINER METHODE ................................................................... 256 11.5.2 UEBERGANG ZUR PRAEPARATIVEN CHROMATOGRAPHIE ..................................................................... 258 11.5.3 FRAKTIONIERUNG ...................................................................................................................... 259 11.5.4 ANALYSE DER FRAKTIONEN ........................................................................................................ 259 11.6 MULTIDIMENSIONALE HPLC ..................................................................................................... 260 11.6.1 TRENNUNG VON INDIVIDUELLEN PEPTIDEN UND PROTEINEN IN DER MD-HPLC .............................. 260 11.6.2 TRENNUNG VON KOMPLEXEN PEPTID UND PROTEINMISCHUNGEN MIT DER MD-HPLC .................. 261 11.6.3 METHODENSTRATEGIEN FUER DIE MD-HPLC .................................................................................. 261 INHALTSVERZEICHNIS XV 11.6.4 ENTWURF EINES EFFEKTIVEN MD-HPLC-SCHEMAS FUER PEPTIDE UND PROTEINE .............................. 262 11.7 SCHLUSSBEMERKUNG ............................................................................................................ 264 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 264 12 ELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN .............................................................................. 265 REINER WESTERMEIER UND ANGELIKA GOERG 12.1 GESCHICHTLICHER UEBERBLICK .................................................................................................. 267 12.2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN ................................................................................................. 268 12.3 INSTRUMENTIERUNG UND DURCHFUEHRUNG VON GELELEKTROPHORESEN ..................................... 271 12.3.1 PROBEN VORBEREITUNG ............................................................................................................ 273 12.3.2 GELMEDIEN FUER ELEKTROPHORESEN ........................................................................................... 273 12.3.3 NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG DER GETRENNTEN PROTEINE ..................................................... 274 12.3.4 ZONENELEKTROPHORESE ........................................................................................................... 277 12.3.5 PORENGRADIENTENGELE ........................................................................................................... 278 12.3.6 PUFFERSYSTEME ...................................................................................................................... 278 12.3.7 DISK-ELEKTROPHORESE ............................................................................................................. 279 12.3.8 SAURE NATIVELEKTROPHORESE ................................................................................................... 280 12.3.9 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE ............................................................................... 280 12.3.10 KATIONISCHE DETERGENSELEKTROPHORESE ................................................................................. 282 12.3.11 BLAUE NATIV-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE ..................................................................... 282 12.3.12 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG ................................................................................................. 282 12.4 PRAEPARATIVE VERFAHREN ....................................................................................................... 287 12.4.1 ELEKTROELUTION AUS GELEN ...................................................................................................... 287 12.4.2 PRAEPARATIVE ZONENELEKTROPHORESE ........................................................................................ 287 12.4.3 PRAEPARATIVE ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG .............................................................................. 288 12.5 TRAEGERFREIE ELEKTROPHORESE ................................................................................................. 290 12.6 HOCHAUFLOESENDE ZWEIDIMENSIONALE ELEKTROPHORESE....................................................... 290 12.6.1 PROBENVORBEREITUNG ............................................................................................................. 292 12.6.2 VORFRAKTIONIERUNG ................................................................................................................ 292 12.6.3 ERSTE DIMENSION: IEF IN IPG-STREIFEN .................................................................................... 293 12.6.4 ZWEITE DIMENSION: SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE ................................................ 294 12.6.5 DETEKTION UND IDENTIFIZIERUNG DER PROTEINE ........................................................................ 294 12.6.6 DIFFERENZGELELEKTROPHORESE (DIGE) ..................................................................................... 294 12.7 ELEKTROBLOTTING ................................................................................................................... 296 12.7.1 BLOTSYSTEME .......................................................................................................................... 296 12.7.2 TRANSFERPUFFER ...................................................................................................................... 298 12.7.3 BLOTMEMBRANEN ................................................................................................................... 298 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 298 13 KAPILLARELEKTROPHORESE ........................................................................................... 299 PHILIPPE SCHMITT-KOPPLIN UND GERHARD K. E. SCRIBA 13.1 GESCHICHTLICHER UEBERBLICK .................................................................................................. 300 13.2 AUFBAU DER KAPILLARELEKTROPHORESE .................................................................................. 300 13.3 GRUNDPRINZIPIEN DER KAPILLARELEKTROPHORESE ................................................................... 301 13.3.1 DER ELEKTROOSMOTISCHE FLUSS (EOF) ...................................................................................... 301 13.3.2 JOULE SCHE WAERMEENTWICKLUNG ............................................................................................ 303 13.3.3 INJEKTION DER PROBEN ............................................................................................................ 303 13.3.4 DETEKTION ............................................................................................................................ 304 13.4 DIE METHODEN DER KAPILLARELEKTROPHORESE...................................................................... 305 13.4.1 KAPILLARZONENELEKTROPHORESE (CZE) ...................................................................................... 305 13.4.2 MICELLARELEKTROKINETISCHE CHROMATOGRAPHIE (MEKC) UND MIKROEMULSION ELEKTROKINETISCHE CHROMATOGRAPHIE (MEEKC) ...................................................................... 310 13.4.3 KAPILLARAFFINITAETSELEKTROPHORESE (ACE) ................................................................................. 313 13.4.4 KAPILLARELEKTROCHROMATOGRAPHIE (CEC) ................................................................................. 313 13.4.5 ENANTIOMERENTRENNUNGEN ................................................................................................... 314 XVI INHALTSVERZEICHNIS 13.4.6 KAPILLARGELELEKTROPHORESE (CGE) ............................................................................................ 314 13.4.7 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (CIEF) ........................................................................................ 317 13.4.8 ISOTACHOPHORESE (ITP) ............................................................................................................ 320 13.5 SPEZIELLE TECHNIKEN............................................................................................................. 321 13.5.1 ONLINE-PROBENKONZENTRIERUNG ............................................................................................. 321 13.5.2 FRAKTIONIERUNG ...................................................................................................................... 321 13.5.3 MIKROCHIPELEKTROPHORESE ...................................................................................................... 323 13.6 AUSBLICK ................................................................................................................................ 324 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 325 14 AMINOSAEUREANALYSE .................................................................................................. 327 JOSEF KELLERMANN 14.1 PROBENVORBEREITUNG ............................................................................................................ 329 14.1.1 SAURE HYDROLYSE .................................................................................................................... 329 14.1.2 ALKALISCHE HYDROLYSE .............................................................................................................. 330 14.1.3 ENZYMATISCHE HYDROLYSE ....................................................................................................... 330 14.2 FREIE AMINOSAEUREN .............................................................................................................. 330 14.3 FLUESSIGCHROMATOGRAPHIE MIT OPTISCHER DETEKTION ............................................................ 330 14.3.1 NACHSAEULENDERIVATISIERUNG .................................................................................................. 330 14.3.2 VORSAEULENDERIVATISIERUNG ..................................................................................................... 333 14.4 AMINOSAEUREANALYSE MIT MASSENSPEKTROMETRISCHER DETEKTION ......................................... 335 14.5 DATENAUSWERTUNG UND BEURTEILUNG DER ANALYSEN ............................................................ 337 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 339 15 PROTEINSEQUENZANALYSE .......................................................................................... 341 FRIEDRICH LOTTSPEICH 15.1 N-TERMINALE SEQUENZANALYSE: DER EDMAN-ABBAU .............................................................. 344 15.1.1 REAKTIONEN DES EDMAN-ABBAUS ........................................................................................... 344 15.1.2 IDENTIFIZIERUNG DER AMINOSAEUREN .......................................................................................... 345 15.1.3 DIE QUALITAET DES EDMAN-ABBAUS: DIE REPETITIVE AUSBEUTE .................................................... 346 15.1.4 INSTRUMENTIERUNG .................................................................................................................. 346 15.1.5 PROBLEME DER AMINOSAEURESEQUENZANALYSE .......................................................................... 350 15.1.6 STAND DER TECHNIK ................................................................................................................. 353 15.2 C-TERMINALE SEQUENZANALYSE............................................................................................. 354 15.2.1 CHEMISCHE ABBAUMETHODEN ............................................................................................... 354 15.2.2 PEPTIDMENGEN UND QUALITAET DES CHEMISCHEN ABBAUS ......................................................... 356 15.2.3 ABBAU DER POLYPEPTIDE MIT CARBOXYPEPTIDASEN ................................................................. 356 15.3 SINGLE MOLECULE PROTEIN SEQUENCING ................................................................................. 357 15.4 AUSBLICK ................................................................................................................................. 357 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 358 16 MASSENSPEKTROMETRIE ............................................................................................. 359 HELMUT E. MEYER, THOMAS FROEHLICH, ECKHARD NORDHOFF UND KATJA KUHLMANN 16.1 LONISATIONSMETHODEN.......................................................................................................... 361 16.1.1 MATRIXASSISTIERTE LASERDESORPTIONS/IONISATIONS-MASSENSPEKTROMETRIE (MALDI-MS) ............ 362 16.1.2 ELEKTROSPRAY-IONISATION (ESI) ................................................................................................ 367 16.2 MASSENANALYSATOREN ............................................................................................................ 374 16.2.1 FLUGZEITANALYSATOR (TOF) ....................................................................................................... 376 16.2.2 QUADRUPOLANALYSATOR ............................................................................................................ 378 16.2.3 ELEKTRISCHE LONENFALLEN .......................................................................................................... 380 16.2.4 MAGNETISCHE LONENFALLE ........................................................................................................ 382 16.2.5 ORBITAL-IONENFALLE .................................................................................................................. 383 16.2.6 HYBRIDGERAETE ......................................................................................................................... 384 16.3 LONENDETEKTOREN ................................................................................................................ 389 16.3.1 SEKUNDAERELEKTRONENVERVIELFACHER (SEV) .............................................................................. 389 INHALTSVERZEICHNIS XVII 16.3.2 FARADAY-BECHER .................................................................................................................... 390 16.4 FRAGMENTIERUNGSTECHNIKEN.............................................................................................. 391 16.4.1 KOLLISIONSINDUZIERTE DISSOZIATION (CID) ................................................................................. 391 16.4.2 PROMPTE UND METASTABILE ZERFAELLE (ISD, PSD) ....................................................................... 392 16.4.3 PHOTONENINDUZIERTE DISSOZIATION (PID, IRMPD) .................................................................... 394 16.4.4 ERZEUGUNG VON RADIKALEN (ECD, HECD, ETD) ....................................................................... 394 16.5 MASSENBESTIMMUNG.......................................................................................................... 396 16.5.1 BERECHNUNG DER MASSE ....................................................................................................... 396 16.5.2 EINFLUSS DER ISOTOPIE ............................................................................................................ 396 16.5.3 KALIBRIERUNG ......................................................................................................................... 400 16.5.4 BESTIMMUNG DER LADUNGSZAHL ............................................................................................ 400 16.5.5 SIGNALVERARBEITUNG UND -AUSWERTUNG ................................................................................. 400 16.5.6 ABLEITUNG DER MASSE ............................................................................................................ 401 16.5.7 PROBLEME ............................................................................................................................. 401 16.6 IDENTIFIZIERUNG, NACHWEIS UND STRUKTURAUFKLAERUNG .......................................................... 402 16.6.1 IDENTIFIZIERUNG ...................................................................................................................... 402 16.6.2 NACHWEIS .............................................................................................................................. 403 16.6.3 STRUKTURAUFKLAERUNG .............................................................................................................. 404 16.7 LC-MS UND LC-MS/MS ......................................................................................................... 410 16.7.1 LC-MS ................................................................................................................................... 410 16.7.2 LC-MS/MS ............................................................................................................................. 412 16.7.3 LONENMOBILITAETSSPEKTROMETRIE (IMS) .................................................................................... 412 16.8 QUANTIFIZIERUNG .................................................................................................................. 413 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 414 17 MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS .................................................... 415 OLIVER POETZ, THOMAS O. JOOS, DIETER STOLL UND MARKUS F. TEMPLIN 17.1 FAENGERMOLEKUELE FUER MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS .................................. 416 17.2 AUSWAHL DER PEPTIDE FUER MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS .......................... 418 17.3 GEZIELTER NACHWEIS VON PROTEINEN UEBER MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS .................................................................... 419 17.4 ANWENDUNG IN DER FORSCHUNG UND KLINIK-PROTEINBIOMARKER ......................................... 420 17.5 PROTEOMWEITE IMMUNAFFINITAETS-MS-BASIERTE ANSAETZE MIT GRUPPENSPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN .............................................................................. 421 17.6 AUSBLICK .............................................................................................................................. 422 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 422 18 BILDGEBENDE MASSENSPEKTROMETRIE .................................................................... 423 BERNHARD SPENGLER 18.1 ANALYTISCHE MIKROSONDEN .................................................................................................. 424 18.2 IMAGES: MASSENSPEKTROMETRISCHE RASTERBILDER ................................................................. 425 18.3 SMALDI-MS: DIE GRENZEN DER AUFLOESUNG........................................................................... 426 18.4 WEITERE METHODEN DER BILDGEBENDEN MASSENSPEKTROMETRIE .......................................... 427 18.5 AUFLOESUNG VERSUS NACHWEISGRENZE ................................................................................... 428 18.6 MS-LMAGING ALS PHAENOMENOLOGISCHE METHODE ................................................................ 429 1 8.7 SMALDI-IMAGING ALS EXAKTE METHODE ............................................................................... 429 18.8 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG .............................................................................. 430 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 431 19 PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN .................................................................... 433 PETER UETZ, EVA-KATHRIN EHMOSER, DAGMAR KLOSTERMEIER, KLAUS RICHTER UND UTE CURTH 19.1 DASTWO-HYBRID-SYSTEM ..................................................................................................... 435 19.1.1 DAS KONZEPT DES TWO-HYBRID-SYSTEMS................................................................................. 435 19.1.2 DIE ELEMENTE DES TWO-HYBRID-SYSTEMS ............................................................................... 436 XVIII INHALTSVERZEICHNIS 19.1.3 KONSTRUKTION DES KOEDERPROTEINS ............................................................................................ 437 19.1.4 WELCHE KOEDERPROTEINE EIGNEN SICH FUER DASTWO-HYBRID-SYSTEM? ......................................... 440 19.1.5 AKTIVATOR-FUSIONSPROTEIN UND CDNA-BIBLIOTHEKEN ................................................................ 440 19.1.6 DURCHFUEHRUNG DESTWO-HYBRID-SCREENINGS .......................................................................... 441 19.1.7 MODIFIZIERTE ANWENDUNGEN UND WEITERENTWICKLUNGEN DERTWO-HYBRID-TECHNOLOGIE ........ 445 19.1.8 BIOCHEMISCHE UND FUNKTIONALE ANALYSE DER INTERAKTOREN .................................................... 446 19.2 TAP-TAGGING UND REINIGUNG VON PROTEINKOMPLEXEN ........................................................ 447 19.2.1 RETROVIRALE TRANSDUKTION ....................................................................................................... 448 19.2.2 TAP-REINIGUNG ...................................................................................................................... 449 19.2.3 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE ........................................................................................ 450 19.2.4 LIMITATIONEN DERTAP-REINIGUNG ............................................................................................ 450 19.3 IN VITRO-LNTERAKTIONSANALYSE: GST-PULLDOWN..................................................................... 450 19.4 KO-IMMUNPRAEZIPITATION ....................................................................................................... 452 19.5 FAR-WESTERN-BLOT ................................................................................................................. 453 19.6 PLASMONENSPEKTROSKOPIE (SURFACE PLASMON RESONANCE) ................................................. 453 19.7 FLUORESZENZ-RESONANZ-ENERGIETRANSFER - FRET ................................................................ 456 19.7.1 FRET-EFFIZIENZEN UND IHRE EXPERIMENTELLE BESTIMMUNG ..................................................... 456 19.7.2 METHODEN DER FRET-MESSUNG ............................................................................................... 458 19.7.3 EINBRINGEN VON FRET-SONDEN IN BIOMOLEKUELE ..................................................................... 460 19.7.4 ANWENDUNGEN VON FRET: INTERAKTIONS-UND STRUKTURANALYSE ................................................ 461 19.7.5 FRET ALS DIAGNOSTISCHES WERKZEUG: BIOSENSOREN ................................................................. 461 19.7.6 AUSBLICK ................................................................................................................................. 462 19.8 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATION ........................................................................................ 462 19.8.1 INSTRUMENTELLE GRUNDLAGEN .................................................................................................. 463 19.8.2 SEDIMENTATIONSGESCHWINDIGKEITSEXPERIMENTE ................................................................... 465 19.8.3 SEDIMENTATIONSGLEICHGEWICHTSEXPERIMENTE ........................................................................ 468 ZITIERTE UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ................................................................................ 470 20 BIO-UND BIOMIMETISCHE SENSOREN ........................................................................ 473 FRIEDER W. SCHELLER, AYSU YARMAN UND REINHARD RENNEBERG 20.1 DAS KONZEPT VON BIO-UND BIOMIMETISCHEN SENSOREN ....................................................... 474 20.2 AUFBAU UND FUNKTION VON BIOSENSOREN............................................................................. 475 20.3 ENZYMELEKTRODEN................................................................................................................. 476 20.3.1 GEKOPPELTE ENZYMREAKTIONEN IN SENSOREN .......................................................................... 477 20.3.2 BIOSENSOREN FUER DIABETES ..................................................................................................... 478 20.4 ZELLSENSOREN ........................................................................................................................ 480 20.4.1 MIKROBIELLE SENSOREN/BIOCHEMISCHER SAUERSTOFFBEDARF VON ABWASSER ............................... 480 20.5 IMMUNSENSOREN................................................................................................................... 480 20.6 BIOMIMETISCHE SENSOREN ..................................................................................................... 482 20.6.1 MOLEKULAR GEPRAEGTE POLYMERE ............................................................................................... 482 20.6.2 APTAMERE .............................................................................................................................. 483 20.7 MIKROFLUIDISCHE SYSTEME ..................................................................................................... 484 20.8 AUSBLICK: VON DER GLUCOSEELEKTRODE ZUM YYEINZEL-MOLEKUEL-TRANSISTOR ............................. 484 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 485 II 3D-STRUKTURAUFKLAERUNG 21 MAGNETISCHE RESONANZSPEKTROSKOPIE VON BIOMOLEKUELEN ................................ 489 MARKUS ZWECKSTETTER, TAD A. HOLAK UND MARTIN SCHWALBE 21.1 NMR-SPEKTROSKOPIE VON BIOMOLEKUELEN ............................................................................. 490 21.1.1 THEORIE DER NMR-SPEKTROSKOPIE .......................................................................................... 490 21.1.2 EINDIMENSIONALE NMR-SPEKTROSKOPIE .................................................................................. 495 21.1.3 ZWEIDIMENSIONALE NMR-SPEKTROSKOPIE................................................................................ 500 INHALTSVERZEICHNIS XIX 21.1.4 DREIDIMENSIONALE NMR-SPEKTROSKOPIE ............................................................................... 506 21.1.5 SIGNALZUORDNUNG ................................................................................................................. 511 21.1.6 BESTIMMUNG DER PROTEINSTRUKTUR ......................................................................................... 516 21.1.7 PROTEINSTRUKTUREN UND MEHR-EIN AUSBLICK ......................................................................... 521 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 526 22 EPR-SPEKTROSKOPIE AN BIOLOGISCHEN SYSTEMEN ................................................. 527 OLAV SCHIEMANN UND GREGOR HAGELUEKEN 22.1 GRUNDLAGEN DER EPR-SPEKTROSKOPIE ................................................................................. 529 22.1.1 ELEKTRONENSPIN UND RESONANZBEDINGUNG .......................................................................... 530 22.1.2 CW-EPR-SPEKTROSKOPIE ......................................................................................................... 531 22.1.3 G-WERT .................................................................................................................................. 532 22.1.4 ELEKTRONENSPIN-KERNSPIN-KOPPLUNG (HYPERFEINKOPPLUNG) .................................................. 532 22.2 G UND HYPERFEINANISOTROPIE ............................................................................................ 533 22.2.1 G-ANISOTROPIE ........................................................................................................................ 534 22.2.2 HYPERFEINANISOTROPIE ........................................................................................................... 535 22.3 ELEKTRONENSPIN-ELEKTRONENSPIN-KOPPLUNG ....................................................................... 536 22.4 GEPULSTE EPR-EXPERIMENTE ................................................................................................. 538 22.4.1 GRUNDLAGEN GEPULSTER EPR ................................................................................................... 539 22.4.2 RELAXATION............................................................................................................................. 540 22.4.3 SPINECHOS ............................................................................................................................. 540 22.4.4 ESEEM ................................................................................................................................. 541 22.4.5 HYSCORE .............................................................................................................................. 542 22.4.6 ENDOR .................................................................................................................................. 543 22.4.7 GEPULSTE DIPOLARE EPR-SPEKTROSKOPIE ................................................................................. 545 22.4.8 VERGLEICH ZWISCHEN PELDOR UND FRET ................................................................................. 548 22.5 WEITERE ANWENDUNGSBEISPIELE FUER EPR ............................................................................ 548 22.5.1 QUANTIFIZIERUNG VON SPINZENTREN/BINDUNGSKONSTANTEN ..................................................... 549 22.5.2 LOKALE PH-WERTE................................................................................................................... 549 22.5.3 MOBILITAET .............................................................................................................................. 549 22.6 GENERELLE BEMERKUNGEN ZUR AUSSAGEKRAFT VON EPR-SPEKTREN ......................................... 550 22.7 VERGLEICH EPR/NMR ............................................................................................................. 551 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 552 23 ELEKTRONENMIKROSKOPIE ......................................................................................... 553 PHILIPP ERDMANN, SVEN KLUMPE UND JUERGEN M. PLITZKO 23.1 HISTORISCHER UEBERBLICK ....................................................................................................... 556 23.2 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE .............................................................................. 557 23.2.1 INSTRUMENTATION ................................................................................................................... 557 23.2.2 ELEKTRONENERZEUGUNG ......................................................................................................... 557 23.2.3 ELEKTRONENLINSEN ................................................................................................................. 558 23.2.4 ELEKTRONENAUFZEICHNUNG ...................................................................................................... 560 23.2.5 OBJEKTTRAEGER UND PROBENHALTER ........................................................................................... 560 23.3 PRAEPARATIONSVERFAHREN ...................................................................................................... 561 23.3.1 NEGATIVKONTRASTIERUNG ......................................................................................................... 562 23.3.2 NATIVE PROBEN IN EIS ............................................................................................................ 564 23.3.3 KRYO-FIB-LAMELLEN............................................................................................................... 566 23.4 ABBILDUNG IM ELEKTRONENMIKROSKOP ................................................................................ 569 23.4.1 AUFLOESUNG DES TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPS .......................................................... 569 23.4.2 WECHSELWIRKUNGEN DES ELEKTRONENSTRAHLS MIT DEM OBJEKT ................................................ 570 23.4.3 PHASENKONTRAST IN DER ELEKTRONENMIKROSKOPIE .................................................................... 572 23.4.4 ELEKTRONENMIKROSKOPIE MIT PHASENPLATTEN ......................................................................... 573 23.4.5 KRYO-ELEKTRONENMIKROSKOPIE ............................................................................................... 575 23.4.6 AUFNAHME VON BILDERN - ELEKTRONENDETEKTOREN .................................................................. 576 XX INHALTSVERZEICHNIS 23.5 BILDVERARBEITUNG FUER DIE 3D-ELEKTRONENMIKROSKOPIE ....................................................... 577 23.5.1 DIE FOURIER-TRANSFORMATION .................................................................................................. 577 23.5.2 EIGENSCHAFTEN UND NUTZEN DER FOURIER-TRANSFORMATION IN DER BILDVERARBEITUNG ................ 579 23.5.3 DIE KONTRASTUEBERTRAGUNGSFUNKTION ....................................................................................... 579 23.5.4 ERHOEHUNG DES SIGNAL-RAUSCH-VERHAELTNISSES .......................................................................... 582 23.6 EINZELPARTIKELANALYSE .......................................................................................................... 583 23.6.1 2D-ALIGNIERUNG UND KLASSIFIZIERUNG....................................................................................... 584 23.6.2 DREIDIMENSIONALE REKONSTRUKTION ........................................................................................ 587 23.6.3 MODELLBILDUNG ...................................................................................................................... 591 23.7 TOMOGRAPHIE ........................................................................................................................ 593 23.7.1 AUFNAHMESCHEMATA .............................................................................................................. 594 23.7.2 REKONSTRUKTION ...................................................................................................................... 595 23.7.3 TEMPLATE MATCHING UND SUBTOMOGRAMM-AVERAGING ........................................................... 597 23.8 PERSPEKTIVEN ........................................................................................................................ 599 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 600 24 RASTERKRAFTMIKROSKOPIE .......................................................................................... 601 NICO STROHMEYER UND DANIEL J. MUELLER 24.1 FUNKTIONSPRINZIP DES RASTERKRAFTMIKROSKOPS ................................................................... 602 24.2 WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN SPITZE UND OBJEKT ................................................................... 604 24.3 PRAEPARATIONSVERFAHREN......................................................................................................... 605 24.4 ABBILDEN BIOLOGISCHER MAKROMOLEKUELE ............................................................................. 605 24.5 KRAFTSPEKTROSKOPIE EINZELNER MOLEKUELE ............................................................................. 606 24.6 MULTIFUNKTIONELLES ABBILDEN VON OBERFLAECHEN ................................................................. 607 24.7 DETEKTION DES FUNKTIONELLEN ZUSTANDS UND DER WECHSELWIRKUNG EINZELNER PROTEINE. ... 607 24.8 ANALYSE DER BIOMECHANISCHEN EIGENSCHAFTEN LEBENDER ZELLEN ....................................... 608 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 610 25 ROENTGENSTRUKTURANALYSE ........................................................................................ 611 DAGMAR KLOSTERMEIER UND MARKUS G. RUDOLPH 25.1 ERZEUGUNG UND DETEKTION VON ROENTGENLICHT .................................................................... 613 25.2 APPARATIVER AUFBAU .............................................................................................................. 614 25.3 STREUUNG UND BEUGUNG VON ROENTGENSTRAHLEN................................................................... 615 25.3.1 KLEINE PHYSIK DER STREUUNG .................................................................................................... 616 25.3.2 KLEINE PHYSIK DER DIFFRAKTION ................................................................................................ 616 25.4 KLEINWINKEL-ROENTGENSTREUUNG (SAXS) ............................................................................... 618 25.4.1 PROBENVORBEREITUNG UND MESSUNG ....................................................................................... 618 25.4.2 ANALYSE VON SAXS-DATEN ....................................................................................................... 618 25.4.3 STRUKTURBESTIMMUNGEN MIT SAXS........................................................................................ 620 25.5 ROENTGENKRISTALLOGRAPHIE..................................................................................................... 622 25.5.1 MAKROMOLEKUELE UND IHRE KRISTALLISATION ................................................................................ 622 25.5.2 KRISTALLE UND IHRE EIGENSCHAFTEN ............................................................................................ 626 25.5.3 DATENSAMMLUNG UND -ANALYSE ............................................................................................. 629 25.5.4 DAS PHASENPROBLEM UND SEINE LOESUNG ................................................................................ 631 25.5.5 MODELLBAU UND STRUKTURVERFEINERUNG .................................................................................. 635 25.5.6 VALIDIERUNG VON STRUKTURMODELLEN ....................................................................................... 637 25.6 AUSBLICK ................................................................................................................................ 638 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 638 III SPEZIELLE STOFFGRUPPEN 26 ANALYTIK SYNTHETISCHER PEPTIDE ............................................................................. 643 ANNETTE G. BECK-SICKINGER UND JAN STICHEL 26.1 PRINZIP DER PEPTIDSYNTHESE ................................................................................................. 644 INHALTSVERZEICHNIS XXI 26.2 UNTERSUCHUNG DER REINHEIT SYNTHETISCHER PEPTIDE ........................................................... 649 26.3 CHARAKTERISIERUNG UND IDENTITAET SYNTHETISCHER PEPTIDE ................................................... 650 26.4 CHARAKTERISIERUNG DER STRUKTUR SYNTHETISCHER PEPTIDE ..................................................... 653 26.5 ANALYTIK VON PEPTIDBIBLIOTHEKEN ...................................................................................... 655 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 657 27 KOHLENHYDRATANALYTIK ............................................................................................ 659 ANDREAS ZAPPE UND KEVIN PAGEL 27.1 THEORETISCHE GRUNDLAGEN .................................................................................................. 660 27.1.1 ALDOSEN UND KETOSEN ........................................................................................................... 660 27.1.2 CYCLISIERUNG ......................................................................................................................... 661 27.1.3 ANOMERER EFFEKT ................................................................................................................... 662 27.1.4 DIE GLYKOSIDISCHE BINDUNG ................................................................................................... 663 27.1.5 OLIGOSACCHARIDE UND GLYKANE .............................................................................................. 666 27.2 ANALYTISCHE ANSAETZE .......................................................................................................... 670 27.2.1 METHODEN ZURTRENNUNG UND ANALYSE VON GLYKANEN .......................................................... 673 27.2.2 MASSENSPEKTROMETRIE ........................................................................................................... 679 27.3 SCHLUSSBETRACHTUNG.......................................................................................................... 687 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 688 28 LIPIDANALYTIK ............................................................................................................ 689 HARTMUT KUEHN 28.1 AUFBAU UND EINTEILUNG VON LIPIDEN................................................................................... 690 28.2 EXTRAKTION VON LIPIDEN AUS BIOLOGISCHEM MATERIAL .......................................................... 692 28.2.1 FLUESSIGPHASENEXTRAKTION ...................................................................................................... 692 28.2.2 FESTPHASENEXTRAKTION ........................................................................................................... 693 28.3 METHODEN DER LIPIDANALYTIK .............................................................................................. 694 28.3.1 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN ......................................................................................... 694 28.3.2 MASSENSPEKTROMETRIE ........................................................................................................... 698 28.3.3 IMMUNASSAYS ........................................................................................................................ 699 28.3.4 WEITERE METHODEN IN DER LIPIDANALYTIK ................................................................................ 700 28.3.5 ONLINE-KOPPLUNG VERSCHIEDENER ANALYSESYSTEME............................................................... 702 28.4 ANALYTIK AUSGEWAEHLTER LIPIDKLASSEN................................................................................ 704 28.4.1 GESAMTLIPIDEXTRAKTE ............................................................................................................. 704 28.4.2 FETTSAEUREN ............................................................................................................................. 704 28.4.3 UNPOLARE NEUTRALLIPIDE ........................................................................................................ 705 28.4.4 POLARE ESTERLIPIDE .................................................................................................................. 707 28.4.5 LIPIDHORMONE UND INTRAZELLULAERE SIGNALTRANSDUKTOREN ....................................................... 710 28.5 LIPIDVITAMINE ..................................................................................................................... 716 28.6 LIPIDOMANALYTIK .................................................................................................................. 719 28.7 AUSBLICK ............................................................................................................................... 720 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 721 29 ANALYTIK POSTTRANSLATIONALER MODIFIKATIONEN: PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVE CYSTEINMODIFIKATION VON PROTEINEN ........ 723 GEREON POSCHMANN, NINA OVERBECK, KATRIN BRENIG UND KAI STUEHLER 29.1 FUNKTIONELLE BEDEUTUNG DER PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATION BEI PROTEINEN ................................................................................... 725 29.1.1 PHOSPHORYLIERUNG ................................................................................................................ 725 29.1.2 OXIDATIVE CYSTEINMODIFIKATION ............................................................................................ 726 29.2 STRATEGIEN ZUR ANALYSE DER POSTTRANSLATIONALEN PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATION VON PROTEINEN UND PEPTIDEN ........................................................... 728 29.3 PROBENVORBEREITUNG, TRENNUNG UND ANREICHERUNG PHOSPHORYLIERTER UND OXIDATIV CYSTEINMODIFIZIERTER PROTEINE UND PEPTIDE ....................................................................... 728 29.3.1 TRENNUNG UND ANREICHERUNG PHOSPHORYLIERTER PROTEINE UND PEPTIDE ............................... 729 XXII INHALTSVERZEICHNIS 29.3.2 PROBENVORBEREITUNG,TRENNUNG UND ANREICHERUNG OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATIONEN VON PROTEINEN UND PEPTIDEN .......................................................................................... 731 29.4 DETEKTION DER PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATIONEN VON PROTEINEN UND PEPTIDEN .............................................................................................. 734 29.4.1 DETEKTION MITTELS ENZYMATISCHER, RADIOAKTIVER, IMMUNCHEMISCHER UND FLUORESZENZBASIERENDER METHODEN ....................................................................................... 734 29.4.2 DETEKTION PHOSPHORYLIERTER UND CYSTEINOXIDIERTER PROTEINE MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE ............................................................................................................ 737 29.5 LOKALISATION UND IDENTIFIZIERUNG POSTTRANSLATIONAL MODIFIZIERTER AMINOSAEUREN ............ 738 29.5.1 LOKALISATION PHOSPHORYLIERTER AMINOSAEUREN MITTELS EDMAN-SEQUENZIERUNG ..................... 738 29.5.2 LOKALISATION PHOSPHORYLIERTER UND CYSTEINOXIDIERTER AMINOSAEUREN MITTELS MASSENSPEKTROMETRISCHER FRAGMENTIONENANALYSE .............................................................. 739 29.6 QUANTITATIVE ANALYSE POSTTRANSLATIONALER MODIFIKATIONEN .............................................. 743 29.7 ZUKUNFT DER ANALYTIK POSTTRANSLATIONALER MODIFIKATIONEN ................................................ 743 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 744 IV NUCLEINSAEUREANALYTIK 30 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON NUDEINSAEUREN ................................................... 749 MARION JURK 30.1 REINIGUNG UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUDEINSAEUREN ..................................... 750 30.1.1 PHENOLEXTRAKTION ................................................................................................................... 750 30.1.2 CHROMATOGRAPHIEVERFAHREN .................................................................................................. 751 30.1.3 ETHANOLPRAEZIPITATION DER NUDEINSAEUREN .............................................................................. 753 30.1.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUDEINSAEUREN ................................................................. 754 30.2 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA .............................................................................................. 755 30.3 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER DNA .................................................................................... 756 30.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN ......................................................................... 756 30.3.2 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER DNA EUKARYOTISCHER ZELLEN ................................................... 760 30.4 ISOLIERUNG VIRALER DNA ........................................................................................................ 761 30.4.1 ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA ................................................................................................ 761 30.4.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS EUKARYOTISCHEN VIREN ...................................................................... 762 30.5 ISOLIERUNG EINZELSTRAENGIGER DNA ......................................................................................... 762 30.5.1 ISOLIERUNG VON ML 3-DNA ....................................................................................................... 762 30.5.2 TRENNUNG VON EINZEL UND DOPPELSTRAENGIGER DNA ................................................................ 763 30.6 ISOLIERUNG VON RNA .............................................................................................................. 763 30.6.1 ISOLIERUNG ZELLULAERER RNA ....................................................................................................... 764 30.6.2 ISOLIERUNG VON POLY(A) + -RNA ................................................................................................ 766 30.6.3 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER RNA ....................................................................................... 767 30.7 ISOLIERUNG VON NUDEINSAEUREN UNTER VERWENDUNG VON MAGNETISCHEN PARTIKELN ............ 767 30.8 LAB-ON-A-CHIP ...................................................................................................................... 767 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 768 31 AUFARBEITUNG UND CHEMISCHE ANALYTIK VON NUDEINSAEUREN .............................. 769 TOBIAS POEHLMANN UND MARION JURK 31.1 VERFAHREN ZUR ANALYTIK VON NUDEINSAEUREN AUS BIOLOGISCHEN PROBEN ............................. 771 31.1.1 ELEKTROPHORESE ...................................................................................................................... 771 31.1.2 FAERBE-UND MARKIERUNGSMETHODEN ....................................................................................... 785 31.1.3 BLOTTINGVERFAHREN ................................................................................................................. 786 31.1.4 RESTRIKTIONSANALYSE ............................................................................................................... 791 31.2 CHEMISCHE ANALYTIK VON NUDEINSAEUREN ............................................................................ 800 31.2.1 HERSTELLUNG VON OLIGONUCLEOTIDEN ....................................................................................... 800 31.2.2 UNTERSUCHUNG DER REINHEIT VON OLIGONUCLEOTIDEN .............................................................. 804 31.2.3 GEL-ELEKTROPHORESE ............................................................................................................... 804 XXIII INHALTSVERZEICHNIS 31.2.4 CHARAKTERISIERUNG VON OLIGONUCLEOTIDEN ............................................................................... 806 31.2.5 AUFREINIGUNG VON NUDEINSAEUREN ............................................................................................ 808 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ................................................................................. 810 32 RNA-STRUKTURAUFKLAERUNG DURCH CHEMISCHE MODIFIKATION .................................. 811 W.-MATTHIAS LEEDER UND H. ULRICH GOERINGER 32.1 GRUNDLAGEN DER RNA-FALTUNG ............................................................................................... 813 32.1.1 RNA-PRIMAERSTRUKTUR................................................................................................................. 813 32.1.2 RNA-SEKUNDAER-UND TERTIAERSTRUKTUR ......................................................................................... 814 32.2 RNA-MODIFIKATIONSREAGENZIEN UND IHRE SPEZIFITAETEN ......................................................... 817 32.2.1 BASENSPEZIFISCHE MODIFIKATIONSREAGENZIEN ............................................................................ 818 32.2.2 BASENUNABHAENGIGE MODIFIKATIONSREAGENZIEN ......................................................................... 818 32.3 IDENTIFIZIERUNG DER MODIFIZIERTEN NUCLEOTIDPOSITIONEN ...................................................... 819 32.4 EXPERIMENTELLE DURCHFUEHRUNG ............................................................................................... 821 32.4.1 RNA-SYNTHESE UND NOTWENDIGE KONTROLLEN ............................................................................ 821 32.4.2 CHEMISCHE MODIFIKATION ......................................................................................................... 821 32.4.3 EINBINDUNG DER MODIFIKATIONSDATEN IN 2D-STRUKTURVORHERSAGEN ............................................ 822 32.5 TRANSKRIPTOMWEITE STRUKTURAUFKLAERUNGEN ........................................................................... 824 32.6 ERWEITERUNG DER STRUKTURAUFKLAERUNGSMOEGLICHKEITEN DURCH MUTATIONAL PROFILING .............. 825 32.7 IN VIVO-MODIFIKATIONEN........................................................................................................... 826 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ................................................................................. 829 33 POLYMERASEKETTENREAKTION ....................................................................................... 831 SANDRA NIENDORF UND C.-THOMAS BOCK 33.1 MOEGLICHKEITEN DER PCR ........................................................................................................... 833 33.2 GRUNDLAGEN .................................................................................................................... 833 33.2.1 ABLAUF EINER PCR-REAKTION ...................................................................................................... 833 33.2.2 INSTRUMENTIERUNG ..................................................................................................................... 835 33.2.3 KOMPONENTEN DER PCR-REAKTION ............................................................................................ 836 33.2.4 OPTIMIERUNG DER PCR-REAKTION.............................................................................................. 838 33.3 SPEZIELLE PCR-TECHNIKEN ....................................................................................................... 839 33.3.1 QUANTITATIVE PCR ..................................................................................................................... 839 33.3.2 REVERSE-TRANSKRIPTASE-PCR ...................................................................................................... 842 33.3.3 NESTED-PCR............................................................................................................................. 844 33.3.4 ASYMMETRISCHE PCR ................................................................................................................ 845 33.3.5 TOUCHDOWN-PCR ...................................................................................................................... 845 33.3.6 MULTIPLEX-PCR ......................................................................................................................... 845 33.3.7 DIRECT CYCLE SEQUENCING ......................................................................................................... 846 33.3.8 IN VFTRO-MUTAGENESE ................................................................................................................ 846 33.3.9 DIGITALE PCR (DPCR; CHAMBER DIGITAL PCR, CDPCR UND DROPLET DIGITAL PCR, DDPCR) ........... 846 33.3.10 EMULSIONS-PCR (EPCR) ............................................................................................................. 848 33.3.11 IMMUNQUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR (IPCR, IQPCR, IRTPCR) ......................................................... 848 33.3.12 INSITU-PCR .............................................................................................................................. 849 33.3.13 WEITERE VERFAHREN ................................................................................................................... 849 33.4 KONTAMINATIONSPROBLEMATIK ................................................................................................ 850 33.4.1 VERMEIDUNG VON KONTAMINATIONEN ......................................................................................... 850 33.4.2 DEKONTAMINATION .................................................................................................................... 851 33.5 ANWENDUNGEN ...................................................................................................................... 852 33.5.1 NACHWEIS VON INFEKTIONSKRANKHEITEN ..................................................................................... 852 33.5.2 NACHWEIS VON GENETISCHEN DEFEKTEN ...................................................................................... 853 33.5.3 HUMANGENOMPROJEKT ............................................................................................................ 854 33.6 ALTERNATIVE VERFAHREN DER AMPLIFIKATION .............................................................................. 855 33.6.1 ISOTHERME PCR ......................................................................................................................... 856 33.6.2 LIGASE CHAIN REACTION (LCR) .................................................................................................... 860 33.6.3 BRANCHED DNA AMPLIFICATION (BDNA) ..................................................................................... 861 XXIV INHALTSVERZEICHNIS 33.7 AUSBLICK ................................................................................................................................ 861 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 862 34 DNA-SEQUENZIERUNG ................................................................................................ 863 ANDREA THUERMER UND KILIAN RUTZEN 34.1 GELGESTUETZTE DNA-SEQUENZIERUNGSVERFAHREN................................................................... 866 34.1.1 SANGER-SEQUENZIERUNG ......................................................................................................... 866 34.2 GELFREIE DNA-SEQUENZIERUNGSMETHODEN ......................................................................... 870 34.2.1 NEXT-GENERATION-SEQUENZIERUNG .......................................................................................... 870 34.2.2 THIRD-GENERATION-SEQUENZIERUNG ........................................................................................ 877 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 882 35 ANALYSE DER EPIGENETISCHEN MODIFIKATIONEN ..................................................... 885 REINHARD DAMMANN 35.1 UEBERBLICK UEBER DIE DETEKTIONSMETHODEN DER DNA-MODIFIKATIONEN ................................. 887 35.2 ANALYSE DER CYTOSIN-MODIFIKATIONEN MIT DER BISULFITTECHNIK ............................................. 887 35.2.1 AMPLIFIKATION UND SEQUENZIERUNG VON BISULFITBEHANDELTER DNA ......................................... 889 35.2.2 RESTRIKTIONSANALYSE NACH BISULFIT-PCR ................................ 890 35.2.3 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR ............................................................................................. 891 35.3 ANALYSE DER DNA MIT METHYLIERUNGSSPEZIFISCHEN RESTRIKTIONSENZYMEN ........................ 893 35.4 METHYLIERUNGSANALYSE DURCH METHYLCYTOSIN-BINDENDE-DOMAENE-PROTEINE ..................... 895 35.5 ANTIKOERPERSPEZIFISCHE ANALYSEN DER MODIFIZIERTE DNA ..................................................... 896 35.6 ANALYSE VON MODIFIZIERTEN BASEN DURCH DNA-HYDROLYSE UND NEAREST-NEIGHBOR-ASSAYS 897 35.7 ANALYSE VON EPIGENETISCHEN MODIFIKATIONEN VON CHROMATINASSOZIIERTEN PROTEINEN .... 898 35.8 CHROMOSOMENKONFORMATIONSANALYSE ............................................................................... 899 35.9 AUSBLICK ................................................................................................................................. 900 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 900 36 PROTEIN-NUDEINSAEURE-WECHSELW-IRKUNGEN ........................................................ 901 ROLF WAGNER UND BENEDIKT M. BECKMANN 36.1 GRUNDLAGEN DER PROTEIN-DNA/RNA-WECHSELWIRKUNG: GEMEINSAMKEITEN UND UNTERSCHIEDE ................................................................................. 902 36.1.1 STRUKTUR VON DNA UND RNA ................................................................................................. 902 36.1.2 DNA UND RNA-BINDUNGSMOTIVE .......................................................................................... 904 36.1.3 GEBRAEUCHLICHE METHODEN ZUR ANALYSE VON NUDEINSAEUREN UND PROTEINEN ......................... 906 36.2 GENERELLE METHODEN (DNA ODER RNA) ............................................................................... 907 36.2.1 FILTERBINDUNG ......................................................................................................................... 907 36.2.2 ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ANALYSIS (EMSA) ..................................................................... 907 36.2.3 CROSSLINKING VON PROTEINEN UND NUDEINSAEUREN ................................................................... 911 36.3 PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN....................................................................................... 912 36.3.1 DNA-FOOTPRINT-ANALYSEN ....................................................................................................... 912 36.3.2 PRIMER-EXTENSION-ANALYSE FUER DNA ....................................................................................... 913 36.3.3 CHROMATIN-IMMUNPRAEZIPITATION (CHIP) ................................................................................ 914 36.3.4 NUCLEOSOME MAPPING, ASSAY FORTRANSPOSASE-ACCESSIBLE CHROMATIN USING SEQUENCING (ATAC-SEQ) ............................................................................................................................ 915 36.4 PROTEIN-RNA-WECHSELWIRKUNGEN....................................................................................... 916 36.4.1 ANALYSE EINZELNER RBPS ......................................................................................................... 916 36.4.2 ANALYSE VON PROTEINEN, DIE MIT EINZELNEN RNAS INTERAGIEREN .............................................. 919 36.4.3 SYSTEMWEITE ANALYSE VON PROTEINEN, DIE MIT RNA INTERAGIEREN ........................................... 920 36.4.4 POLYSOME/RIBOSOME PROFILING ............................................................................................... 923 36.5 AUSBLICK ............................................................................................................................... 924 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 924 INHALTSVERZEICHNIS XXV V SYSTEMATISCHE FUNKTIONSANALYTIK 37 SEQUENZANALYSE ....................................................................................................... 929 BORIS STEIPE 37.1 SEQUENZANALYSE UND BIOINFORMATIK ................................................................................... 930 37.2 DATENBANKEN....................................................................................................................... 931 37.2.1 SEQUENZABRUF AUS OEFFENTLICHEN DATENBANKEN ...................................................................... 932 37.2.2 DATEN UND DATENFORMAT ...................................................................................................... 934 37.3 WEBDIENSTE ........................................................................................................................ 934 37.3.1 EMBOSS ................................................................................................................................ 934 37.4 SEQUENZZUSAMMENSETZUNG ............................................................................................... 936 37.4.1 SEQUENZTENDENZEN .............................................................................................................. 937 37.5 MUSTER IN SEQUENZEN ......................................................................................................... 938 37.5.1 ZEICHENKETTEN UND REGULAER EXPRESSIONS .............................................................................. 939 37.5.2 GEWICHTUNGSMATRIZEN ......................................................................................................... 939 37.5.3 SEQUENZPROFILE ..................................................................................................................... 940 37.5.4 ANWENDUNGSBEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG CODIERENDER BEREICHE IN DNA .................................. 940 37.5.5 ANWENDUNGSBEISPIEL: PROTEINLOKALISIERUNG ......................................................................... 941 37.6 HOMOLOGIE .......................................................................................................................... 941 37.6.1 IDENTITAET, AEHNLICHKEIT UND HOMOLOGIE ................................................................................. 942 37.6.2 OPTIMALES ALIGNMENT ........................................................................................................... 943 37.6.3 ALIGNMENT FUER SCHNELLE DATENBANKSUCHEN: BLAST ............................................................... 944 37.6.4 ORTHOLOGE UND PARALOGE SEQUENZEN ................................................................................... 946 37.6.5 PROFILBASIERTE DATENBANKSUCHEN: PSI-BLAST ....................................................................... 946 37.7 MULTIPLES ALIGNMENT UND KONSENSUSSEQUENZEN ............................................................... 947 37.8 SEQUENZ UND STRUKTUR ........................................................................................................ 949 37.9 FUNKTION .............................................................................................................................. 950 37.10 AUSBLICK ............................................................................................................................... 951 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 952 38 HYBRIDISIERUNG FLUORESZENZMARKIERTER DNA ZUR GENOMANALYSE IN DER MOLEKULAREN CYTOGENETIK ...................................................................................... 953 GUDRUN GOEHRING, DORIS STEINEMANN, MICHELLE NESSLING UND KARSTEN RICHTER 38.1 METHODEN ZUR HYBRIDISIERUNG FLUORESZENZMARKIERTER DNA.............................................. 954 38.1.1 MARKIERUNGSSTRATEGIE ........................................................................................................... 954 38.1.2 DNA-SONDEN ........................................................................................................................ 955 38.1.3 MARKIERUNG DER DNA-SONDEN .............................................................................................. 956 38.1.4 IN SITU-HYBRIDISIERUNG ......................................................................................................... 956 38.1.5 FLUORESZENZAUSWERTUNG DER HYBRIDISIERUNGSSIGNALE .......................................................... 957 38.2 ANWENDUNGEN: FISH UND CGH ........................................................................................... 957 38.2.1 ANALYSE GENOMISCHER DNA DURCH FISH ............................................................................... 957 38.2.2 VERGLEICHENDE GENOMISCHE HYBRIDISIERUNG (CGH) .............................................................. 960 38.2.3 SNP-ARRAY ............................................................................................................................. 963 38.2.4 NEUE ENTWICKLUNGEN ZUR DETEKTION VON KOPIENZAHLVERAENDERUNGEN IM GENOM ................ 963 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .......................... 963 39 PHYSIKALISCHE, GENETISCHE UND FUNKTIONELLE KARTIERUNG DES GENOMS ......... 965 CHRISTIAN MAERCKER 39.1 PHYSIKALISCHE KARTIERUNG.................................................................................................... 966 39.2 GENETISCHE KARTIERUNG ....................................................................................................... 967 39.2.1 REKOMBINATION .................................................................................................................... 967 39.2.2 GENETISCHE MARKER .............................................................................................................. 967 39.2.3 KOPPLUNGSANALYSE-DIE ERSTELLUNG GENETISCHER KARTEN ....................................................... 969 XXVI INHALTSVERZEICHNIS 39.2.4 DIE GENETISCHE KARTE DES MENSCHLICHEN GENOMS ................................................................ 971 39.2.5 KARTIERUNG VON GENETISCH BEDINGTEN KRANKHEITEN .............................................................. 972 39.3 FUNKTIONELLE KARTIERUNG DES GENOMS ................................................................................ 973 39.3.1 CHARAKTERISIERUNG VON KRANKHEITSGENEN ............................................................................... 973 39.3.2 MUTATIONEN ALS URSACHE VERERBBARER KRANKHEITEN ................................................................ 975 39.3.3 TRANSKRIPTKARTEN .................................................................................................................... 976 39.3.4 ZELLULAERE ASSAYS ZUR CHARAKTERISIERUNG VON GENFUNKTIONEN ................................................. 977 39.4 INTEGRATION DER GENOMKARTEN ............................................................................................. 979 39.5 DAS MENSCHLICHE GENOM ..................................................................................................... 979 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 980 40 DNA-MICROARRAY-TECHNOLOGIE ................................................................................ 983 JOERG HOHEISEL 40.1 RNA-ANALYSEN ...................................................................................................................... 984 40.1.1 ANALYSE DERTRANSKRIPTMENGEN ............................................................................................. 984 40.1.2 RNA-REIFUNG ......................................................................................................................... 986 40.1.3 RNA-STRUKTUR UND FUNKTIONALITAET .......................................................................................... 987 40.2 DNA-ANALYSEN ...................................................................................................................... 987 40.2.1 GENOTYPISIERUNG ................................................................................................................... 987 40.2.2 EPIGENETISCHE STUDIEN .......................................................................................................... 987 40.2.3 DNA-SEQUENZIERUNG .............................................................................................................. 989 40.2.4 ANALYSE DER KOPIENZAHL GENOMISCHER DNA-ABSCHNITTE ........................................................ 990 40.2.5 PROTEIN-DNA-INTERAKTIONEN .................................................................................................. 990 40.2.6 GENOMWEITE IDENTIFIZIERUNG FUNKTIONELL-ESSENZIELLER GENE ................................................. 991 40.3 MOLEKUELSYNTHESE ................................................................................................................. 993 40.3.1 DNA-SYNTHESE....................................................................................................................... 993 40.3.2 CHIPGEBUNDENE PROTEINEXPRESSION ....................................................................................... 993 40.4 NEUE ANSAETZE ...................................................................................................................... 993 40.4.1 EINE UNIVERSELLE CHIP-PLATTFORM ............................................................................................ 993 40.4.2 STRUKTURANALYSEN ................................................................................................................... 994 40.4.3 JENSEITS VON NUDEINSAEUREN .................................................................................................. 995 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 995 41 SILENCING-TECHNOLOGIEN ZUR ANALYSE VON GENFUNKTIONEN ................................ 997 JENS KURRECK 41.1 ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDE .................................................................................................. 998 41.1.1 WIRKWEISEN VON ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDEN ...................................................................... 999 41.1.2 MODIFIKATIONEN VON OLIGONUCLEOTIDEN ZUR STEIGERUNG DER NUCLEASESTABILITAET ..................... 1000 41.1.3 EINSATZ VON ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDEN IN ZELLKULTUR UND IN TIERMODELLEN ........................ 1002 41.2 RNA-INTERFERENZ UND MICRORNAS ....................................................................................... 1003 41.2.1 GRUNDLAGEN DER RNA-INTERFERENZ .......................................................................................... 1003 41.2.2 ANWENDUNG DER RNAI-TECHNOLOGIE....................................................................................... 1004 41.2.3 RNA-INTERFERENZ DURCH EXPRESSIONSVEKTOREN ........................................................................ 1005 41.2.4 GENOMWEITE SCREENS MIT RNAI ............................................................................................. 1005 41.2.5 MICRORNAS ............................................................................................................................ 1006 41.3 CRISPR/CAS-TECHNOLOGIE ..................................................................................................... 1007 41.3.1 BIOLOGISCHE FUNKTION DES CRISPR/CAS-SYSTEMS ..................................................................... 1008 41.3.2 CRISPR/CAS-ANWENDUNGEN IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN ......................................................... 1008 41.4 INDUZIERTE PLURIPOTENTE STAMMZELLEN ................................................................................. 1010 41.5 AUSBLICK ................................................................................................................................. 1011 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 1012 42 PROTEOMANALYSE ........................................................................................................ 1013 FRIEDRICH LOTTSPEICH, KEVIN JOOSS, NEIL L. KELLEHER, MICHAEL GOETZE, BETTY FRIEDRICH UND RUEDI AEBERSOLD 42.1 DEFINITION DER AUSGANGSBEDINGUNGEN UND DER FRAGESTELLUNG, PROJEKTPLANUNG ............ 1017 INHALTSVERZEICHNIS XXVII 42.2 PROBENVORBEREITUNG........................................................................................................... 1018 42.3 QUANTITATIVE ANALYSE DER PROTEINE ..................................................................................... 1 020 42.4 KLASSISCHE GELBASIERTE PROTEOMANALYSE ............................................................................ 1 020 42.4.1 PROBENVORBEREITUNG ............................................................................................................ 1020 42.4.2 TRENNUNG DER PROTEINE ......................................................................................................... 1020 42.4.3 FAERBUNG DER PROTEINE ........................................................................................................... 1021 42.4.4 BILDVERARBEITUNG UND QUANTIFIZIERUNG DER PROTEINE, DATENANALYSE..................................... 1021 42.4.5 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PROTEINE ............................................................ 1022 42.4.6 ZWEIDIMENSIONALE DIFFERENZIELLE GELELEKTROPHORESE (2D-DIGE).......................................... 1023 42.5 TOP-DOWN-PROTEOMICS: MASSENSPEKTROMETRIE VON INTAKTEN PROTEINEN ........................ 1024 42.5.1 GRUNDLAGEN INTAKTER PROTEIN-MASSENSPEKTROMETRIE ............................................................ 1024 42.5.2 DEKONVOLUTION VON PROTEINMASSENSPEKTREN ....................................................................... 1027 42.5.3 FRAGMENTIERUNG VON PROTEINEN ........................................................................................... 1029 42.5.4 DATENAUSWERTUNG ................................................................................................................ 1029 42.5.5 TOP-DOWN-PROTEOMICS IN DER HOCHDURCHSATZANALYSE .......................................................... 1032 42.5.6 NATIVE TOP-DOWN-MASSENSPEKTROMETRIE .............................................................................. 1034 42.5.7 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK ........................................................................................ 1036 42.6 BOTTOM-UP-PROTEOMANALYSE ............................................................................................ 1037 42.6.1 BOTTOM-UP-PROTEOMICS ........................................................................................................ 1037 42.6.2 BOTTOM-UP-STRATEGIEN ......................................................................................................... 1039 42.6.3 QUANTITATIVE PEPTIDANALYSE ................................................................................................. 1041 42.6.4 DATENABHAENGIGE ANALYSE (DDA) ........................................................................................... 1041 42.6.5 SELECTED REACTION MONITORING (SRM)................................................................................... 1042 42.6.6 SWATH-MS ........................................................................................................................... 1048 42.6.7 ERWEITERUNGEN ..................................................................................................................... 1050 42.6.8 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................................. 1051 42.7 ISOTOPENLABEL-BASIERTE PROTEOMANALYSEN ........................................................................ 1051 42.7.1 ISOTOPENLABELING-STRATEGIEN FUER TOP-DOWN-PROTEOMICS ...................................................... 1053 42.7.2 ISOTOPENLABELSTRATEGIEN FUER BOTTOM-UP-PROTEOMANALYSEN .................................................. 1058 42.7.3 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................................. 1061 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 1062 43 METABOLOMICS ........................................................................................................... 1065 CHRISTIAN G. HUBER 43.1 TECHNOLOGISCHE PLATTFORMEN FUER METABOLOMICS ................................................................. 1068 43.1.1 NMR-BASIERTE METABOLOMICS ................................................................................................ 1069 43.1.2 MASSENSPEKTROMETRIE-BASIERTE METABOLOMICS .................................................................... 1071 43.2 DATENAUSWERTUNG UND BIOLOGISCHE INTERPRETATION ........................................................... 1074 43.3 METABOLISCHES FINGERPRINTING ............................................................................................ 1076 43.4 UNSPEZIFISCHE METABOLOMICS UND METABONOMICS ........................................................... 1076 43.5 SPEZIFISCHE METABOLOMICS UND METABOLITEN-PROFILING ..................................................... 1 077 43.6 ANWENDUNGSFELDER ............................................................................................................. 1079 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 1079 44 INTERAKTOMICS - SYSTEMATISCHE ANALYSE VON PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN .................................................................... 1081 MARKUS F. TEMPLIN, THOMAS O. JOOS, OLIVER POELZ UND DIETER STOLL 44.1 PROTEIN-MICROARRAYS ............................................................................................................ 1083 44.1.1 SENSITIVITAET DURCH MINIATURISIERUNG - AMBIENT ANALYTE ASSAY ............................................. 1084 44.1.2 VON DNA-ZU PROTEIN-MICROARRAYS......................................................................................... 1084 44.1.3 ANWENDUNGEN VON PROTEIN-MICROARRAYS .............................................................................. 1086 44.2 DISKUSSION UND AUSBLICK ..................................................................................................... 1089 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 1090 45 CHEMISCHE BIOLOGIE ................................................................................................. 1091 DANIEL RAUH UND SUSANNE BRAKMANN XXVIII INHALTSVERZEICHNIS 45.1 CHEMISCHE BIOLOGIE - INNOVATIVE CHEMISCHE ANSAETZE ZUM STUDIUM BIOLOGISCHER FRAGESTELLUNGEN ................................................................................................................... 1092 45.2 CHEMISCHE GENETIK - KLEINE ORGANISCHE MOLEKUELE ZUR MODULATION VON PROTEINFUNKTIONEN .................................................................................... 1094 45.2.1 DAS STUDIUM VON PROTEINFUNKTIONEN MIT KLEINEN ORGANISCHEN MOLEKUELEN .......................... 1095 45.2.2 VORWAERTS UND RUECKWAERTS GERICHTETE CHEMISCHE GENETIK ...................................................... 1097 45.2.3 CHEMO-GENOMISCHE ANSAETZE AM BEISPIEL DER BUMP-AND-HOLE-METHODE .......................... 1098 45.2.4 IDENTIFIZIERUNG VON KINASE-SUBSTRATEN MITHILFE DER ASKA-TECHNOLOGIE............................... 1102 45.2.5 BIOLOGISCHE SYSTEME MIT KLEINEN ORGANISCHEN MOLEKUELEN SCHALTBAR MACHEN ..................... 1102 45.2.6 MODIFIKATION VON PROTEINEN DURCH ERWEITERUNG DES GENETISCHEN CODES ............................ 1104 45.3 LIGATION EXPRIMIERTER PROTEINE - STUDIUM DER POSTTRANSLATIONALEN MODIFIKATION VON PROTEINEN ............................................................................................................................. 1104 45.3.1 ANALYSE LIPIDIERTER PROTEINE .................................................................................................. 1105 45.3.2 ANALYSE PHOSPHORYLIERTER PROTEINE ....................................................................................... 1106 45.4 CHEMISCHE BIOLOGIE DER NUDEINSAEUREN ............................................................................. 1107 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 1108 46 TOPONOMANALYSE ....................................................................................................... 1109 WALTER SCHUBERT 46.1 KONZEPT DES PROTEINTOPONOMS ........................................................................................... 1111 46.2 IMAGING CYCLER ROBOTS: GRUNDLAGE EINER TOPONOMLESETECHNOLOGIE ................................. 1112 46.3 EIN BEISPIEL: SPEZIFITAET UND SELEKTIVITAET DES ZELLOBERFLAECHENTOPONOMS .......................... 1113 46.4 METHODEN DER TOPONOMANALYSE ......................................................................................... 1114 46.4.1 MULTI-EPITOP-LIGAND-KARTOGRAPHIE (MELK) ........................................................................... 1114 46.4.2 PROBENVORBEREITUNG UND ANTIKOERPERKALIBRIERUNG ................................................................ 1120 46.4.3 WERKZEUGE ZUR VISUALISIERUNG VON TOPONOMDATENSAETZEN .................................................... 1121 46.4.4 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG TOPOLOGISCHER MOLEKUELHIERARCHIEN .................................... 1122 46.5 HOCHAUFLOESENDE TOPONOME: BIOMARKER FUER ERFOLGREICHE THERAPIEN................................. 1123 46.6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ....................................................................................... 1123 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 1125 47 ORGAN-ON-CHIP .......................................................................................................... 1127 PETER LOSKILL UND ALEXANDER MOSIG 47.1 GRUNDLAGEN .......................................................................................................................... 1129 47.1.1 MIKROFLUIDIK ........................................................................................................................... 1129 47.1.2 (BIO-)MATERIALIEN .................................................................................................................... 1130 47.1.3 ZELLQUELLEN ............................................................................................................................ 1131 47.2 BEISPIELE VON ORGAN-ON-CHIP-SYSTEMEN ........................................................................... 1134 47.2.1 GEWEBE MIT BARRIEREFUNKTION ............................................................................................... 1134 47.2.2 GEWEBE MIT STOFFWECHSELFUNKTION ....................................................................................... 1135 47.2.3 GEWEBE MIT MECHANISCHER FUNKTION .................................................................................... 1136 47.2.4 NEURONALE GEWEBE ............................................................................................................... 1136 47.2.5 MULTI-ORGAN-SYSTEME ............................................................................................................ 1138 47.3 ANALYTISCHE MOEGLICHKEITEN ................................................................................................. 1138 47.3.1 IN-CHIP-ANALYSE .................................................................................................................... 1139 47.3.2 OFF-CHIP-PERFUSATANALYSE ..................................................................................................... 1140 47.3.3 TERMINALE EX-SITU-ANALYTIK .................................................................................................... 1140 47.4 ANWENDUNGSGEBIETE DER OOC-TECHNOLOGIE ..................................................................... 1141 47.4.1 WIRKSAMKEITSTESTUNG ............................................................................................................ 1141 47.4.2 TOXIKOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN .......................................................................................... 1142 47.4.3 PHARMAKOKINETIK .................................................................................................................. 1142 47.4.4 PERSONALISIERTE MEDIZIN ......................................................................................................... 1143 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR ............................................................................... 1143 XXIX INHALTSVERZEICHNIS 48 SYSTEMBIOLOGIE ........................................................................................................ 1145 OLAF WOLKENHAUER UND TOM GEBHARDT 48.1 METHODISCHER URSPRUNG SYSTEMBIOLOGISCHER ANSAETZE ...................................................... 1146 48.2 DER BEGRIFF DES SYSTEMS UND DESSEN DARSTELLUNG ALS NETZWERK UND GRAPH .................... 1147 48.2.1 ZELLULAERE FUNKTIONEN, REALISIERT DURCH DIE REGULIERUNG VON PROZESSEN ................................ 1147 48.2.2 DIE BESCHREIBUNG ZELLULAERER MECHANISMEN ALS DYNAMISCHE SYSTEME.................................. 1148 48.3 DIE ROLLE DER MODELLIERUNG IN DER MOLEKULAR UND ZELLBIOLOGIE ....................................... 1148 48.3.1 METHODISCHE ANSAETZE........................................................................................................... 1149 48.4 DER BEGRIFF DES PATHWAYS UND SEINE GRENZEN .................................................................... 1150 48.4.1 ABSTRAKTIONEN UND ANNAHMEN ALS GRUNDLAGE ZUR UNTERSUCHUNG KOMPLEXER SYSTEME ....... 1150 48.4.2 STANDARDS ALS TREIBER FUER AUSTAUSCH UND KOOPERATION ......................................................... 1151 48.5 ANSAETZE ZUR KONSTRUKTION UND ANALYSE VON MODELLEN ...................................................... 1151 48.5.1 KONSTRUKTION ........................................................................................................................ 1151 48.5.2 ANALYSE ................................................................................................................................ 1152 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR .............................................................................. 1153 SERVICETEIL STANDARD-AMINOSAEUREN ...................................................................................................... 1156 NUDEINSAEUREN UND KOHLENHYDRATE ..................................................................................... 1157 AUSGEWAEHLTE WICHTIGE LIPIDE .............................................................................................. 1158 STICHWORTVERZEICHNIS ........................................................................................................... 1159
adam_txt	XI INHALTSVERZEICHNIS 1 BIOANALYTIK-EINE EIGENSTAENDIGE WISSENSCHAFT . 1 JENS KURRECK, FRIEDRICH LOTTSPEICH UND JOACHIM W. ENGELS 1.1 PARADIGMENWECHSEL IN DER BIOCHEMIE: VON DER PROTEINCHEMIE ZUR SYSTEMBIOLOGIE . 3 1.1.1 KLASSISCHE STRATEGIE . 3 1.1.2 HOLISTISCHE STRATEGIE . 3 1.2 METHODEN BEGRUENDEN FORTSCHRITT . 4 1.2.1 PROTEINANALYTIK . 6 1.2.2 MOLEKULARBIOLOGIE . 7 1.2.3 BIOINFORMATIK . 9 1.2.4 FUNKTIONSANALYSE . 9 1 PROTEINANALYTIK 2 PROTEINREINIGUNG . 13 FRIEDRICH LOTTSPEICH 2.1 EIGENSCHAFTEN VON PROTEINEN . 14 2.2 PROTEINLOKALISATION UND REINIGUNGSSTRATEGIE . 17 2.3 HOMOGENISIERUNG UND ZELLAUFSCHLUSS. 18 2.4 DIE FAELLUNG. 20 2.5 ZENTRIFUGATION . 21 2.5.1 GRUNDLAGEN . 22 2.5.2 ZENTRIFUGATIONSTECHNIKEN . 23 2.6 ABTRENNUNG VON SALZEN ODER HYDROPHILEN VERUNREINIGUNGEN . 25 2.7 KONZENTRIERUNG . 27 2.8 DETERGENZIEN UND IHRE ENTFERNUNG . 28 2.8.1 EIGENSCHAFTEN VON DETERGENZIEN . 28 2.8.2 ENTFERNEN VON DETERGENZIEN . 31 2.9 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE PROTEOMANALYSE . 32 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 32 3 PROTEINBESTIMMUNGEN . 33 LUTZ FISCHER 3.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DURCH FAERBETESTS . 35 3.1.1 BIURET-ASSAY . 37 3.1.2 LOWRY-ASSAY . 37 3.1.3 BICINCHONINSAEURE-ASSAY (BCA-ASSAY) . 38 3.1.4 BRADFORD-ASSAY . 38 3.2 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN . 39 3.2.1 MESSUNGEN IM UV-BEREICH. 39 3.2.2 FLUORESZENZMETHODE . 41 3.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PEPTIDEN UND PROTEINEN . 41 3.3.1 LODIERUNGEN . 42 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 44 4 ENZYMATISCHE AKTIVITAETSTESTS . 45 HANS BISSWANGER 4.1 MICHAELIS-MENTEN-GLEICHUNG . 46 4.2 KRITERIEN FUER DIE KONZENTRATIONEN DER TESTSUBSTANZEN . 49 4.3 EINFLUESSE AUF DIE ENZYMAKTIVITAET. 49 4.3.1 PH-ABHAENGIGKEIT . 49 4.3.2 ABHAENGIGKEIT VON DER LONENSTAERKE . 50 XII INHALTSVERZEICHNIS 4.3.3 ABHAENGIGKEIT VON DER TEMPERATUR . 50 4.3.4 STABILITAET VON ENZYMEN . 51 4.4 AUFBAU EINES TESTSYSTEMS . 52 4.4.1 GENERELLE VORGEHENSWEISE BEI ENZYMTESTS . 52 4.4.2 KONZIPIERUNG EINES SPEZIELLEN TESTVERFAHRENS. 52 4.5 MESSTECHNIKEN . 54 4.5.1 OPTISCHE METHODEN . 54 4.5.2 ELEKTROCHEMISCHE METHODEN . 55 4.5.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG . 56 4.5.4 CHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN . 56 4.5.5 DIVERSE METHODEN . 56 5 MIKROKALORIMETRIE . 59 ALFRED BLUME 5.1 DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (DSC) . 61 5.2 ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY (ITC) . 67 5.2.1 BINDUNG VON LIGANDEN AN PROTEINE . 67 5.2.2 BINDUNG VON MOLEKUELEN AN MEMBRANEN: EINBAU UND PERIPHERE BINDUNG . T2 5.3 PRESSURE PERTURBATION CALORIMETRY (PPC) . 75 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 76 6 IMMUNOLOGISCHE TECHNIKEN . 77 HYUN-DONG CHANG UND REINHOLD PAUL LINKE 6.1 ANTIKOERPER . 78 6.1.1 ANTIKOERPER UND IMMUNABWEHR . 78 6.1.2 ANTIKOERPER ALS REAGENS . 78 6.1.3 EIGENSCHAFTEN VON ANTIKOERPERN . 79 6.1.4 FUNKTIONELLE STRUKTUR VON IGG . 81 6.1.5 ANTIGENBINDUNGSSTELLE (HAFTSTELLE) . 82 6.1.6 HANDHABUNG VON ANTIKOERPERN . 83 6.2 ANTIGENE . 84 6.3 ANTIGEN-ANTIKOERPER-REAKTION . 85 6.3.1 IMMUNAGGLUTINATION . 86 6.3.2 IMMUNPRAEZIPITATION . 87 6.3.3 IMMUNBINDUNG . 97 6.4 KOMPLEMENTFIXATION . 106 6.5 METHODEN DER ZELLULAEREN IMMUNOLOGIE . 106 6.5.1 IMMUNHISTOCHEMIE, IMMUNCYTOCHEMIE . 106 6.5.2 DURCHFLUSSCYTOMETRIE . 108 6.5.3 SERIELLES ZELLSORTIERVERFAHREN . 111 6.5.4 PARALLELE ZELLSORTIERVERFAHREN . 111 6.6 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN . 112 6.6.1 ARTEN VON ANTIKOERPERN . 112 6.6.2 AUSBLICK: KUENFTIGE ERWEITERUNG DER BINDUNGSKONZEPTE . 114 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 115 7 CHEMISCHE MODIFIKATION VON PROTEINEN UND PROTEINKOMPLEXEN . 117 SYLVIA ELS-HEINDL, ANETTE KAISER, KATHRIN BELLMANN-SICKERT UND ANNETTE G BECK-SICKINGER 7.1 CHEMISCHE MODIFIKATION FUNKTIONELLER GRUPPEN VON PROTEINEN . 119 7.1.1 LYSINRESTE . 119 7.1.2 CYSTEINRESTE . 122 7.1.3 GLUTAMAT-UND ASPARTATRESTE . 123 7.1.4 ARGININRESTE . 124 7.1.5 TYROSINRESTE . 124 7.1.6 TRYPTOPHANRESTE . 125 INHALTSVERZEICHNIS XIII 7.1.7 METHIONINRESTE . 126 7.1.8 HISTIDINRESTE . 126 7.2 MODIFIZIERUNG ALS MITTEL ZUR EINFUEHRUNG VON REPORTERGRUPPEN . 127 7.2.1 UNTERSUCHUNGEN AN NATUERLICH VORKOMMENDEN PROTEINEN . 127 7.2.2 UNTERSUCHUNGEN AN MUTIERTEN PROTEINEN . 130 7.3 PROTEIN-CROSSLINKING ZUR ANALYSE VON PROTEINWECHSELWIRKUNGEN . 132 7.3.1 BIFUNKTIONELLE REAGENZIEN . 133 7.3.2 PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG . 133 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 143 8 SPEKTROSKOPIE . 145 WERNER MAENTELE 8.1 PHYSIKALISCHE PRINZIPIEN UND MESSTECHNIKEN . 147 8.1.1 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN OPTISCHER SPEKTROSKOPISCHER MESSMETHODEN . 147 8.1.2 WECHSELWIRKUNG LICHT-MATERIE . 148 8.1.3 ABSORPTIONSMESSUNGEN . 156 8.1.4 PHOTOMETER . 159 8.1.5 KINETISCHE SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN . 160 8.2 UV/VIS/NIR-SPEKTROSKOPIE . 162 8.2.1 GRUNDLAGEN . 162 8.2.2 CHROMOPROTEINE . 162 8.3 IR-SPEKTROSKOPIE . 168 8.3.1 GRUNDLAGEN . 168 8.3.2 MOLEKUELSCHWINGUNGEN . 170 8.3.3 MESSTECHNIKEN . 171 8.3.4 INFRAROTSPEKTROSKOPIE VON PROTEINEN . 174 8.4 RAMAN-SPEKTROSKOPIE. 177 8.4.1 GRUNDLAGEN . 177 8.4.2 RAMAN-EXPERIMENTE. 178 8.4.3 RESONANZ-RAMAN-SPEKTROSKOPIE . 178 8.5 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE . 180 8.5.1 GRUNDLAGEN . 180 8.5.2 FLUORESZENZSPEKTREN ALS EMISSIONSSPEKTREN UND ALS AKTIONSSPEKTREN . 181 8.5.3 FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN MIT INTRINSISCHEN UND EXTRINSISCHEN FLUOROPHOREN . 182 8.5.4 SPEZIELLE FLUORESZENZTECHNIKEN: FRAP, FLIM, FCS.TIRF . 184 8.5.5 FOERSTER-RESONANZ-ENERGIETRANSFER (FRET) . 185 8.5.6 EINZELMOLEKUELSPEKTROSKOPIE . 185 8.6 METHODEN MIT POLARISIERTEM LICHT . 186 8.6.1 LINEARDICHROISMUS . 186 8.6.2 OPTISCHE ROTATIONSDISPERSION UND CIRCULARDICHROISMUS . 189 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 191 9 LICHTMIKROSKOPISCHE VERFAHREN - IMAGING . 193 THOMAS QUAST UND WALDEMAR KOLANUS 9.1 WEGBEREITER DER MIKROSKOPIE - VON EINFACHEN LINSEN ZU HOCHAUFLOESENDEN MIKROSKOPEN . 195 9.2 MODERNE ANWENDUNGSBEREICHE. 197 9.3 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN . 197 9.3.1 PHAENOMENE DER BEUGUNG UND BILDENTSTEHUNG . 201 9.4 NACHWEISMETHODEN . 202 9.4.1 HISTOLOGISCHE FAERBUNGEN . 203 9.4.2 PHYSIKALISCHE FAERBUNGEN . 203 9.4.3 PHYSIKOCHEMISCHE VORGAENGE BEI FAERBUNGEN (ELEKTROADSORPTION) . 204 9.4.4 CHEMISCHE FAERBUNGEN . 204 9.4.5 FLUORESZENZMARKIERUNG . 204 9.4.6 DIREKTE UND INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG . 204 XIV INHALTSVERZEICHNIS 9.4.7 IN VITRO-MARKIERUNG MIT ORGANISCHEN FLUOROCHROMEN . 205 9.4.8 FLUORESZENZMARKIERUNG FUER LIVE CELL IMAGING . 205 9.4.9 IN V/VO-MARKIERUNG MIT ORGANISCHEN FLUOROCHROMEN . 205 9.4.10 MARKIERUNG MIT QUANTUM DOTS . 205 9.4.11 IN V/VO-MARKIERUNG MIT FLUORESZIERENDEN FUSIONSPROTEINEN (GFP UND VARIANTEN) . 206 9.4.12 FLUOROCHROME UND LICHTQUELLEN FUER DIE FLUORESZENZMIKROSKOPIE . 207 9.5 PRAEPARATIONSMETHODEN . 209 9.5.1 ISOLIERTE ZELLEN . 209 9.5.2 GEWEBEBIOPSIEN . 210 9.5.3 PARAFFINPRAEPARATE . 210 9.5.4 GEFRIERSCHNITTE . 211 9.6 SPEZIELLE FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE ANALYTIK . 211 9.6.1 CLSM (CONFOCAL LASER SCANNING MICROSCOPY) . 211 9.6.2 MULTI-PHOTON FLUORESCENCE MICROSCOPY . 212 9.6.3 KONFOKALE HIGH-SPEED-SPINNING-DISK-SYSTEME (NIPKOW-SYSTEME) . 214 9.6.4 LIVE CELL IMAGING . 214 9.6.5 LICHTMIKROSKOPISCHE SUPERAUFLOESUNG JENSEITS DES ABBE-LIMITS . 215 9.6.6 MESSUNG VON MOLEKUELBEWEGUNGEN . 217 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 223 10 SPALTUNG VON PROTEINEN . 225 JOSEF KELLERMANN 10.1 PROTEOLYTISCHE ENZYME . 226 10.2 STRATEGIE . 227 10.3 DENATURIERUNG . 228 10.4 SPALTUNG VON DISULFIDBRUECKEN UND ALKYLIERUNG . 228 10.5 ENZYMATISCHE FRAGMENTIERUNG . 229 10.5.1 PROTEASEN . 229 10.5.2 PROTEOLYSEBEDINGUNGEN . 234 10.6 CHEMISCHE FRAGMENTIERUNG. 235 10.7 ZUSAMMENFASSUNG . 236 LITERATUR . 237 11 CHROMATOGRAPHISCHE TRENNMETHODEN FUER PEPTIDE UND PROTEINE . 239 REINHARD BOYSEN 11.1 INSTRUMENTIERUNG . 241 11.2 CHROMATOGRAPHISCHE THEORIE . 242 11.3 DIE PHYSIKO-CHEMISCHEN CHARAKTERISTIKA DER PEPTIDE UND PROTEINE . 245 11.4 CHROMATOGRAPHISCHE TRENNMETHODEN . 246 11.4.1 AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE . 247 11.4.2 HOCHLEISTUNGS-REVERSED-PHASE-CHROMATOGRAPHIE (HP-RPC) . 248 11.4.3 HOCHLEISTUNGSNORMALPHASE-CHROMATOGRAPHIE (HP-NPC) . 249 11.4.4 HOCHLEISTUNGS-HYDROPHILE-INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE (HP-HILIC). 250 11.4.5 HOCHLEISTUNGS-AQUEOUS-NORMALPHASECHROMATOGRAPHIE (HP-ANPC) . 250 11.4.6 HOCHLEISTUNGS-HYDROPHOBE-INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE (HP-HIC) . 251 11.4.7 HOCHLEISTUNGSIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE (HP-IEX) . 253 11.4.8 HOCHLEISTUNGSAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE (HP-AC) . 254 11.5 METHODENENTWICKLUNG FUER DIE ANALYTISCHE CHROMATOGRAPHIE AM BEISPIEL DER HP-RPC. . 256 11.5.1 ENTWICKLUNG UND OPTIMIERUNG EINER METHODE . 256 11.5.2 UEBERGANG ZUR PRAEPARATIVEN CHROMATOGRAPHIE . 258 11.5.3 FRAKTIONIERUNG . 259 11.5.4 ANALYSE DER FRAKTIONEN . 259 11.6 MULTIDIMENSIONALE HPLC . 260 11.6.1 TRENNUNG VON INDIVIDUELLEN PEPTIDEN UND PROTEINEN IN DER MD-HPLC . 260 11.6.2 TRENNUNG VON KOMPLEXEN PEPTID UND PROTEINMISCHUNGEN MIT DER MD-HPLC . 261 11.6.3 METHODENSTRATEGIEN FUER DIE MD-HPLC . 261 INHALTSVERZEICHNIS XV 11.6.4 ENTWURF EINES EFFEKTIVEN MD-HPLC-SCHEMAS FUER PEPTIDE UND PROTEINE . 262 11.7 SCHLUSSBEMERKUNG . 264 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 264 12 ELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN . 265 REINER WESTERMEIER UND ANGELIKA GOERG 12.1 GESCHICHTLICHER UEBERBLICK . 267 12.2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN . 268 12.3 INSTRUMENTIERUNG UND DURCHFUEHRUNG VON GELELEKTROPHORESEN . 271 12.3.1 PROBEN VORBEREITUNG . 273 12.3.2 GELMEDIEN FUER ELEKTROPHORESEN . 273 12.3.3 NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG DER GETRENNTEN PROTEINE . 274 12.3.4 ZONENELEKTROPHORESE . 277 12.3.5 PORENGRADIENTENGELE . 278 12.3.6 PUFFERSYSTEME . 278 12.3.7 DISK-ELEKTROPHORESE . 279 12.3.8 SAURE NATIVELEKTROPHORESE . 280 12.3.9 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE . 280 12.3.10 KATIONISCHE DETERGENSELEKTROPHORESE . 282 12.3.11 BLAUE NATIV-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE . 282 12.3.12 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG . 282 12.4 PRAEPARATIVE VERFAHREN . 287 12.4.1 ELEKTROELUTION AUS GELEN . 287 12.4.2 PRAEPARATIVE ZONENELEKTROPHORESE . 287 12.4.3 PRAEPARATIVE ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG . 288 12.5 TRAEGERFREIE ELEKTROPHORESE . 290 12.6 HOCHAUFLOESENDE ZWEIDIMENSIONALE ELEKTROPHORESE. 290 12.6.1 PROBENVORBEREITUNG . 292 12.6.2 VORFRAKTIONIERUNG . 292 12.6.3 ERSTE DIMENSION: IEF IN IPG-STREIFEN . 293 12.6.4 ZWEITE DIMENSION: SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE . 294 12.6.5 DETEKTION UND IDENTIFIZIERUNG DER PROTEINE . 294 12.6.6 DIFFERENZGELELEKTROPHORESE (DIGE) . 294 12.7 ELEKTROBLOTTING . 296 12.7.1 BLOTSYSTEME . 296 12.7.2 TRANSFERPUFFER . 298 12.7.3 BLOTMEMBRANEN . 298 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 298 13 KAPILLARELEKTROPHORESE . 299 PHILIPPE SCHMITT-KOPPLIN UND GERHARD K. E. SCRIBA 13.1 GESCHICHTLICHER UEBERBLICK . 300 13.2 AUFBAU DER KAPILLARELEKTROPHORESE . 300 13.3 GRUNDPRINZIPIEN DER KAPILLARELEKTROPHORESE . 301 13.3.1 DER ELEKTROOSMOTISCHE FLUSS (EOF) . 301 13.3.2 JOULE'SCHE WAERMEENTWICKLUNG . 303 13.3.3 INJEKTION DER PROBEN . 303 13.3.4 DETEKTION . 304 13.4 DIE METHODEN DER KAPILLARELEKTROPHORESE. 305 13.4.1 KAPILLARZONENELEKTROPHORESE (CZE) . 305 13.4.2 MICELLARELEKTROKINETISCHE CHROMATOGRAPHIE (MEKC) UND MIKROEMULSION ELEKTROKINETISCHE CHROMATOGRAPHIE (MEEKC) . 310 13.4.3 KAPILLARAFFINITAETSELEKTROPHORESE (ACE) . 313 13.4.4 KAPILLARELEKTROCHROMATOGRAPHIE (CEC) . 313 13.4.5 ENANTIOMERENTRENNUNGEN . 314 XVI INHALTSVERZEICHNIS 13.4.6 KAPILLARGELELEKTROPHORESE (CGE) . 314 13.4.7 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (CIEF) . 317 13.4.8 ISOTACHOPHORESE (ITP) . 320 13.5 SPEZIELLE TECHNIKEN. 321 13.5.1 ONLINE-PROBENKONZENTRIERUNG . 321 13.5.2 FRAKTIONIERUNG . 321 13.5.3 MIKROCHIPELEKTROPHORESE . 323 13.6 AUSBLICK . 324 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 325 14 AMINOSAEUREANALYSE . 327 JOSEF KELLERMANN 14.1 PROBENVORBEREITUNG . 329 14.1.1 SAURE HYDROLYSE . 329 14.1.2 ALKALISCHE HYDROLYSE . 330 14.1.3 ENZYMATISCHE HYDROLYSE . 330 14.2 FREIE AMINOSAEUREN . 330 14.3 FLUESSIGCHROMATOGRAPHIE MIT OPTISCHER DETEKTION . 330 14.3.1 NACHSAEULENDERIVATISIERUNG . 330 14.3.2 VORSAEULENDERIVATISIERUNG . 333 14.4 AMINOSAEUREANALYSE MIT MASSENSPEKTROMETRISCHER DETEKTION . 335 14.5 DATENAUSWERTUNG UND BEURTEILUNG DER ANALYSEN . 337 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 339 15 PROTEINSEQUENZANALYSE . 341 FRIEDRICH LOTTSPEICH 15.1 N-TERMINALE SEQUENZANALYSE: DER EDMAN-ABBAU . 344 15.1.1 REAKTIONEN DES EDMAN-ABBAUS . 344 15.1.2 IDENTIFIZIERUNG DER AMINOSAEUREN . 345 15.1.3 DIE QUALITAET DES EDMAN-ABBAUS: DIE REPETITIVE AUSBEUTE . 346 15.1.4 INSTRUMENTIERUNG . 346 15.1.5 PROBLEME DER AMINOSAEURESEQUENZANALYSE . 350 15.1.6 STAND DER TECHNIK . 353 15.2 C-TERMINALE SEQUENZANALYSE. 354 15.2.1 CHEMISCHE ABBAUMETHODEN . 354 15.2.2 PEPTIDMENGEN UND QUALITAET DES CHEMISCHEN ABBAUS . 356 15.2.3 ABBAU DER POLYPEPTIDE MIT CARBOXYPEPTIDASEN . 356 15.3 SINGLE MOLECULE PROTEIN SEQUENCING . 357 15.4 AUSBLICK . 357 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 358 16 MASSENSPEKTROMETRIE . 359 HELMUT E. MEYER, THOMAS FROEHLICH, ECKHARD NORDHOFF UND KATJA KUHLMANN 16.1 LONISATIONSMETHODEN. 361 16.1.1 MATRIXASSISTIERTE LASERDESORPTIONS/IONISATIONS-MASSENSPEKTROMETRIE (MALDI-MS) . 362 16.1.2 ELEKTROSPRAY-IONISATION (ESI) . 367 16.2 MASSENANALYSATOREN . 374 16.2.1 FLUGZEITANALYSATOR (TOF) . 376 16.2.2 QUADRUPOLANALYSATOR . 378 16.2.3 ELEKTRISCHE LONENFALLEN . 380 16.2.4 MAGNETISCHE LONENFALLE . 382 16.2.5 ORBITAL-IONENFALLE . 383 16.2.6 HYBRIDGERAETE . 384 16.3 LONENDETEKTOREN . 389 16.3.1 SEKUNDAERELEKTRONENVERVIELFACHER (SEV) . 389 INHALTSVERZEICHNIS XVII 16.3.2 FARADAY-BECHER . 390 16.4 FRAGMENTIERUNGSTECHNIKEN. 391 16.4.1 KOLLISIONSINDUZIERTE DISSOZIATION (CID) . 391 16.4.2 PROMPTE UND METASTABILE ZERFAELLE (ISD, PSD) . 392 16.4.3 PHOTONENINDUZIERTE DISSOZIATION (PID, IRMPD) . 394 16.4.4 ERZEUGUNG VON RADIKALEN (ECD, HECD, ETD) . 394 16.5 MASSENBESTIMMUNG. 396 16.5.1 BERECHNUNG DER MASSE . 396 16.5.2 EINFLUSS DER ISOTOPIE . 396 16.5.3 KALIBRIERUNG . 400 16.5.4 BESTIMMUNG DER LADUNGSZAHL . 400 16.5.5 SIGNALVERARBEITUNG UND -AUSWERTUNG . 400 16.5.6 ABLEITUNG DER MASSE . 401 16.5.7 PROBLEME . 401 16.6 IDENTIFIZIERUNG, NACHWEIS UND STRUKTURAUFKLAERUNG . 402 16.6.1 IDENTIFIZIERUNG . 402 16.6.2 NACHWEIS . 403 16.6.3 STRUKTURAUFKLAERUNG . 404 16.7 LC-MS UND LC-MS/MS . 410 16.7.1 LC-MS . 410 16.7.2 LC-MS/MS . 412 16.7.3 LONENMOBILITAETSSPEKTROMETRIE (IMS) . 412 16.8 QUANTIFIZIERUNG . 413 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 414 17 MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS . 415 OLIVER POETZ, THOMAS O. JOOS, DIETER STOLL UND MARKUS F. TEMPLIN 17.1 FAENGERMOLEKUELE FUER MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS . 416 17.2 AUSWAHL DER PEPTIDE FUER MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS . 418 17.3 GEZIELTER NACHWEIS VON PROTEINEN UEBER MASSENSPEKTROMETRIEBASIERTE IMMUNASSAYS . 419 17.4 ANWENDUNG IN DER FORSCHUNG UND KLINIK-PROTEINBIOMARKER . 420 17.5 PROTEOMWEITE IMMUNAFFINITAETS-MS-BASIERTE ANSAETZE MIT GRUPPENSPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN . 421 17.6 AUSBLICK . 422 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 422 18 BILDGEBENDE MASSENSPEKTROMETRIE . 423 BERNHARD SPENGLER 18.1 ANALYTISCHE MIKROSONDEN . 424 18.2 IMAGES: MASSENSPEKTROMETRISCHE RASTERBILDER . 425 18.3 SMALDI-MS: DIE GRENZEN DER AUFLOESUNG. 426 18.4 WEITERE METHODEN DER BILDGEBENDEN MASSENSPEKTROMETRIE . 427 18.5 AUFLOESUNG VERSUS NACHWEISGRENZE . 428 18.6 MS-LMAGING ALS PHAENOMENOLOGISCHE METHODE . 429 1 8.7 SMALDI-IMAGING ALS EXAKTE METHODE . 429 18.8 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG . 430 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 431 19 PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN . 433 PETER UETZ, EVA-KATHRIN EHMOSER, DAGMAR KLOSTERMEIER, KLAUS RICHTER UND UTE CURTH 19.1 DASTWO-HYBRID-SYSTEM . 435 19.1.1 DAS KONZEPT DES TWO-HYBRID-SYSTEMS. 435 19.1.2 DIE ELEMENTE DES TWO-HYBRID-SYSTEMS . 436 XVIII INHALTSVERZEICHNIS 19.1.3 KONSTRUKTION DES KOEDERPROTEINS . 437 19.1.4 WELCHE KOEDERPROTEINE EIGNEN SICH FUER DASTWO-HYBRID-SYSTEM? . 440 19.1.5 AKTIVATOR-FUSIONSPROTEIN UND CDNA-BIBLIOTHEKEN . 440 19.1.6 DURCHFUEHRUNG DESTWO-HYBRID-SCREENINGS . 441 19.1.7 MODIFIZIERTE ANWENDUNGEN UND WEITERENTWICKLUNGEN DERTWO-HYBRID-TECHNOLOGIE . 445 19.1.8 BIOCHEMISCHE UND FUNKTIONALE ANALYSE DER INTERAKTOREN . 446 19.2 TAP-TAGGING UND REINIGUNG VON PROTEINKOMPLEXEN . 447 19.2.1 RETROVIRALE TRANSDUKTION . 448 19.2.2 TAP-REINIGUNG . 449 19.2.3 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE . 450 19.2.4 LIMITATIONEN DERTAP-REINIGUNG . 450 19.3 IN VITRO-LNTERAKTIONSANALYSE: GST-PULLDOWN. 450 19.4 KO-IMMUNPRAEZIPITATION . 452 19.5 FAR-WESTERN-BLOT . 453 19.6 PLASMONENSPEKTROSKOPIE (SURFACE PLASMON RESONANCE) . 453 19.7 FLUORESZENZ-RESONANZ-ENERGIETRANSFER - FRET . 456 19.7.1 FRET-EFFIZIENZEN UND IHRE EXPERIMENTELLE BESTIMMUNG . 456 19.7.2 METHODEN DER FRET-MESSUNG . 458 19.7.3 EINBRINGEN VON FRET-SONDEN IN BIOMOLEKUELE . 460 19.7.4 ANWENDUNGEN VON FRET: INTERAKTIONS-UND STRUKTURANALYSE . 461 19.7.5 FRET ALS DIAGNOSTISCHES WERKZEUG: BIOSENSOREN . 461 19.7.6 AUSBLICK . 462 19.8 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATION . 462 19.8.1 INSTRUMENTELLE GRUNDLAGEN . 463 19.8.2 SEDIMENTATIONSGESCHWINDIGKEITSEXPERIMENTE . 465 19.8.3 SEDIMENTATIONSGLEICHGEWICHTSEXPERIMENTE . 468 ZITIERTE UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 470 20 BIO-UND BIOMIMETISCHE SENSOREN . 473 FRIEDER W. SCHELLER, AYSU YARMAN UND REINHARD RENNEBERG 20.1 DAS KONZEPT VON BIO-UND BIOMIMETISCHEN SENSOREN . 474 20.2 AUFBAU UND FUNKTION VON BIOSENSOREN. 475 20.3 ENZYMELEKTRODEN. 476 20.3.1 GEKOPPELTE ENZYMREAKTIONEN IN SENSOREN . 477 20.3.2 BIOSENSOREN FUER DIABETES . 478 20.4 ZELLSENSOREN . 480 20.4.1 MIKROBIELLE SENSOREN/BIOCHEMISCHER SAUERSTOFFBEDARF VON ABWASSER . 480 20.5 IMMUNSENSOREN. 480 20.6 BIOMIMETISCHE SENSOREN . 482 20.6.1 MOLEKULAR GEPRAEGTE POLYMERE . 482 20.6.2 APTAMERE . 483 20.7 MIKROFLUIDISCHE SYSTEME . 484 20.8 AUSBLICK: VON DER GLUCOSEELEKTRODE ZUM YYEINZEL-MOLEKUEL-TRANSISTOR" . 484 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 485 II 3D-STRUKTURAUFKLAERUNG 21 MAGNETISCHE RESONANZSPEKTROSKOPIE VON BIOMOLEKUELEN . 489 MARKUS ZWECKSTETTER, TAD A. HOLAK UND MARTIN SCHWALBE 21.1 NMR-SPEKTROSKOPIE VON BIOMOLEKUELEN . 490 21.1.1 THEORIE DER NMR-SPEKTROSKOPIE . 490 21.1.2 EINDIMENSIONALE NMR-SPEKTROSKOPIE . 495 21.1.3 ZWEIDIMENSIONALE NMR-SPEKTROSKOPIE. 500 INHALTSVERZEICHNIS XIX 21.1.4 DREIDIMENSIONALE NMR-SPEKTROSKOPIE . 506 21.1.5 SIGNALZUORDNUNG . 511 21.1.6 BESTIMMUNG DER PROTEINSTRUKTUR . 516 21.1.7 PROTEINSTRUKTUREN UND MEHR-EIN AUSBLICK . 521 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 526 22 EPR-SPEKTROSKOPIE AN BIOLOGISCHEN SYSTEMEN . 527 OLAV SCHIEMANN UND GREGOR HAGELUEKEN 22.1 GRUNDLAGEN DER EPR-SPEKTROSKOPIE . 529 22.1.1 ELEKTRONENSPIN UND RESONANZBEDINGUNG . 530 22.1.2 CW-EPR-SPEKTROSKOPIE . 531 22.1.3 G-WERT . 532 22.1.4 ELEKTRONENSPIN-KERNSPIN-KOPPLUNG (HYPERFEINKOPPLUNG) . 532 22.2 G UND HYPERFEINANISOTROPIE . 533 22.2.1 G-ANISOTROPIE . 534 22.2.2 HYPERFEINANISOTROPIE . 535 22.3 ELEKTRONENSPIN-ELEKTRONENSPIN-KOPPLUNG . 536 22.4 GEPULSTE EPR-EXPERIMENTE . 538 22.4.1 GRUNDLAGEN GEPULSTER EPR . 539 22.4.2 RELAXATION. 540 22.4.3 SPINECHOS . 540 22.4.4 ESEEM . 541 22.4.5 HYSCORE . 542 22.4.6 ENDOR . 543 22.4.7 GEPULSTE DIPOLARE EPR-SPEKTROSKOPIE . 545 22.4.8 VERGLEICH ZWISCHEN PELDOR UND FRET . 548 22.5 WEITERE ANWENDUNGSBEISPIELE FUER EPR . 548 22.5.1 QUANTIFIZIERUNG VON SPINZENTREN/BINDUNGSKONSTANTEN . 549 22.5.2 LOKALE PH-WERTE. 549 22.5.3 MOBILITAET . 549 22.6 GENERELLE BEMERKUNGEN ZUR AUSSAGEKRAFT VON EPR-SPEKTREN . 550 22.7 VERGLEICH EPR/NMR . 551 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 552 23 ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 553 PHILIPP ERDMANN, SVEN KLUMPE UND JUERGEN M. PLITZKO 23.1 HISTORISCHER UEBERBLICK . 556 23.2 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE . 557 23.2.1 INSTRUMENTATION . 557 23.2.2 ELEKTRONENERZEUGUNG . 557 23.2.3 ELEKTRONENLINSEN . 558 23.2.4 ELEKTRONENAUFZEICHNUNG . 560 23.2.5 OBJEKTTRAEGER UND PROBENHALTER . 560 23.3 PRAEPARATIONSVERFAHREN . 561 23.3.1 NEGATIVKONTRASTIERUNG . 562 23.3.2 NATIVE PROBEN IN EIS . 564 23.3.3 KRYO-FIB-LAMELLEN. 566 23.4 ABBILDUNG IM ELEKTRONENMIKROSKOP . 569 23.4.1 AUFLOESUNG DES TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPS . 569 23.4.2 WECHSELWIRKUNGEN DES ELEKTRONENSTRAHLS MIT DEM OBJEKT . 570 23.4.3 PHASENKONTRAST IN DER ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 572 23.4.4 ELEKTRONENMIKROSKOPIE MIT PHASENPLATTEN . 573 23.4.5 KRYO-ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 575 23.4.6 AUFNAHME VON BILDERN - ELEKTRONENDETEKTOREN . 576 XX INHALTSVERZEICHNIS 23.5 BILDVERARBEITUNG FUER DIE 3D-ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 577 23.5.1 DIE FOURIER-TRANSFORMATION . 577 23.5.2 EIGENSCHAFTEN UND NUTZEN DER FOURIER-TRANSFORMATION IN DER BILDVERARBEITUNG . 579 23.5.3 DIE KONTRASTUEBERTRAGUNGSFUNKTION . 579 23.5.4 ERHOEHUNG DES SIGNAL-RAUSCH-VERHAELTNISSES . 582 23.6 EINZELPARTIKELANALYSE . 583 23.6.1 2D-ALIGNIERUNG UND KLASSIFIZIERUNG. 584 23.6.2 DREIDIMENSIONALE REKONSTRUKTION . 587 23.6.3 MODELLBILDUNG . 591 23.7 TOMOGRAPHIE . 593 23.7.1 AUFNAHMESCHEMATA . 594 23.7.2 REKONSTRUKTION . 595 23.7.3 TEMPLATE MATCHING UND SUBTOMOGRAMM-AVERAGING . 597 23.8 PERSPEKTIVEN . 599 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 600 24 RASTERKRAFTMIKROSKOPIE . 601 NICO STROHMEYER UND DANIEL J. MUELLER 24.1 FUNKTIONSPRINZIP DES RASTERKRAFTMIKROSKOPS . 602 24.2 WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN SPITZE UND OBJEKT . 604 24.3 PRAEPARATIONSVERFAHREN. 605 24.4 ABBILDEN BIOLOGISCHER MAKROMOLEKUELE . 605 24.5 KRAFTSPEKTROSKOPIE EINZELNER MOLEKUELE . 606 24.6 MULTIFUNKTIONELLES ABBILDEN VON OBERFLAECHEN . 607 24.7 DETEKTION DES FUNKTIONELLEN ZUSTANDS UND DER WECHSELWIRKUNG EINZELNER PROTEINE. . 607 24.8 ANALYSE DER BIOMECHANISCHEN EIGENSCHAFTEN LEBENDER ZELLEN . 608 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 610 25 ROENTGENSTRUKTURANALYSE . 611 DAGMAR KLOSTERMEIER UND MARKUS G. RUDOLPH 25.1 ERZEUGUNG UND DETEKTION VON ROENTGENLICHT . 613 25.2 APPARATIVER AUFBAU . 614 25.3 STREUUNG UND BEUGUNG VON ROENTGENSTRAHLEN. 615 25.3.1 KLEINE PHYSIK DER STREUUNG . 616 25.3.2 KLEINE PHYSIK DER DIFFRAKTION . 616 25.4 KLEINWINKEL-ROENTGENSTREUUNG (SAXS) . 618 25.4.1 PROBENVORBEREITUNG UND MESSUNG . 618 25.4.2 ANALYSE VON SAXS-DATEN . 618 25.4.3 STRUKTURBESTIMMUNGEN MIT SAXS. 620 25.5 ROENTGENKRISTALLOGRAPHIE. 622 25.5.1 MAKROMOLEKUELE UND IHRE KRISTALLISATION . 622 25.5.2 KRISTALLE UND IHRE EIGENSCHAFTEN . 626 25.5.3 DATENSAMMLUNG UND -ANALYSE . 629 25.5.4 DAS PHASENPROBLEM UND SEINE LOESUNG . 631 25.5.5 MODELLBAU UND STRUKTURVERFEINERUNG . 635 25.5.6 VALIDIERUNG VON STRUKTURMODELLEN . 637 25.6 AUSBLICK . 638 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 638 III SPEZIELLE STOFFGRUPPEN 26 ANALYTIK SYNTHETISCHER PEPTIDE . 643 ANNETTE G. BECK-SICKINGER UND JAN STICHEL 26.1 PRINZIP DER PEPTIDSYNTHESE . 644 INHALTSVERZEICHNIS XXI 26.2 UNTERSUCHUNG DER REINHEIT SYNTHETISCHER PEPTIDE . 649 26.3 CHARAKTERISIERUNG UND IDENTITAET SYNTHETISCHER PEPTIDE . 650 26.4 CHARAKTERISIERUNG DER STRUKTUR SYNTHETISCHER PEPTIDE . 653 26.5 ANALYTIK VON PEPTIDBIBLIOTHEKEN . 655 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 657 27 KOHLENHYDRATANALYTIK . 659 ANDREAS ZAPPE UND KEVIN PAGEL 27.1 THEORETISCHE GRUNDLAGEN . 660 27.1.1 ALDOSEN UND KETOSEN . 660 27.1.2 CYCLISIERUNG . 661 27.1.3 ANOMERER EFFEKT . 662 27.1.4 DIE GLYKOSIDISCHE BINDUNG . 663 27.1.5 OLIGOSACCHARIDE UND GLYKANE . 666 27.2 ANALYTISCHE ANSAETZE . 670 27.2.1 METHODEN ZURTRENNUNG UND ANALYSE VON GLYKANEN . 673 27.2.2 MASSENSPEKTROMETRIE . 679 27.3 SCHLUSSBETRACHTUNG. 687 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 688 28 LIPIDANALYTIK . 689 HARTMUT KUEHN 28.1 AUFBAU UND EINTEILUNG VON LIPIDEN. 690 28.2 EXTRAKTION VON LIPIDEN AUS BIOLOGISCHEM MATERIAL . 692 28.2.1 FLUESSIGPHASENEXTRAKTION . 692 28.2.2 FESTPHASENEXTRAKTION . 693 28.3 METHODEN DER LIPIDANALYTIK . 694 28.3.1 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN . 694 28.3.2 MASSENSPEKTROMETRIE . 698 28.3.3 IMMUNASSAYS . 699 28.3.4 WEITERE METHODEN IN DER LIPIDANALYTIK . 700 28.3.5 ONLINE-KOPPLUNG VERSCHIEDENER ANALYSESYSTEME. 702 28.4 ANALYTIK AUSGEWAEHLTER LIPIDKLASSEN. 704 28.4.1 GESAMTLIPIDEXTRAKTE . 704 28.4.2 FETTSAEUREN . 704 28.4.3 UNPOLARE NEUTRALLIPIDE . 705 28.4.4 POLARE ESTERLIPIDE . 707 28.4.5 LIPIDHORMONE UND INTRAZELLULAERE SIGNALTRANSDUKTOREN . 710 28.5 LIPIDVITAMINE . 716 28.6 LIPIDOMANALYTIK . 719 28.7 AUSBLICK . 720 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 721 29 ANALYTIK POSTTRANSLATIONALER MODIFIKATIONEN: PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVE CYSTEINMODIFIKATION VON PROTEINEN . 723 GEREON POSCHMANN, NINA OVERBECK, KATRIN BRENIG UND KAI STUEHLER 29.1 FUNKTIONELLE BEDEUTUNG DER PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATION BEI PROTEINEN . 725 29.1.1 PHOSPHORYLIERUNG . 725 29.1.2 OXIDATIVE CYSTEINMODIFIKATION . 726 29.2 STRATEGIEN ZUR ANALYSE DER POSTTRANSLATIONALEN PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATION VON PROTEINEN UND PEPTIDEN . 728 29.3 PROBENVORBEREITUNG, TRENNUNG UND ANREICHERUNG PHOSPHORYLIERTER UND OXIDATIV CYSTEINMODIFIZIERTER PROTEINE UND PEPTIDE . 728 29.3.1 TRENNUNG UND ANREICHERUNG PHOSPHORYLIERTER PROTEINE UND PEPTIDE . 729 XXII INHALTSVERZEICHNIS 29.3.2 PROBENVORBEREITUNG,TRENNUNG UND ANREICHERUNG OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATIONEN VON PROTEINEN UND PEPTIDEN . 731 29.4 DETEKTION DER PHOSPHORYLIERUNG UND OXIDATIVER CYSTEINMODIFIKATIONEN VON PROTEINEN UND PEPTIDEN . 734 29.4.1 DETEKTION MITTELS ENZYMATISCHER, RADIOAKTIVER, IMMUNCHEMISCHER UND FLUORESZENZBASIERENDER METHODEN . 734 29.4.2 DETEKTION PHOSPHORYLIERTER UND CYSTEINOXIDIERTER PROTEINE MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE . 737 29.5 LOKALISATION UND IDENTIFIZIERUNG POSTTRANSLATIONAL MODIFIZIERTER AMINOSAEUREN . 738 29.5.1 LOKALISATION PHOSPHORYLIERTER AMINOSAEUREN MITTELS EDMAN-SEQUENZIERUNG . 738 29.5.2 LOKALISATION PHOSPHORYLIERTER UND CYSTEINOXIDIERTER AMINOSAEUREN MITTELS MASSENSPEKTROMETRISCHER FRAGMENTIONENANALYSE . 739 29.6 QUANTITATIVE ANALYSE POSTTRANSLATIONALER MODIFIKATIONEN . 743 29.7 ZUKUNFT DER ANALYTIK POSTTRANSLATIONALER MODIFIKATIONEN . 743 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 744 IV NUCLEINSAEUREANALYTIK 30 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON NUDEINSAEUREN . 749 MARION JURK 30.1 REINIGUNG UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUDEINSAEUREN . 750 30.1.1 PHENOLEXTRAKTION . 750 30.1.2 CHROMATOGRAPHIEVERFAHREN . 751 30.1.3 ETHANOLPRAEZIPITATION DER NUDEINSAEUREN . 753 30.1.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUDEINSAEUREN . 754 30.2 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA . 755 30.3 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER DNA . 756 30.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN . 756 30.3.2 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER DNA EUKARYOTISCHER ZELLEN . 760 30.4 ISOLIERUNG VIRALER DNA . 761 30.4.1 ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA . 761 30.4.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS EUKARYOTISCHEN VIREN . 762 30.5 ISOLIERUNG EINZELSTRAENGIGER DNA . 762 30.5.1 ISOLIERUNG VON ML 3-DNA . 762 30.5.2 TRENNUNG VON EINZEL UND DOPPELSTRAENGIGER DNA . 763 30.6 ISOLIERUNG VON RNA . 763 30.6.1 ISOLIERUNG ZELLULAERER RNA . 764 30.6.2 ISOLIERUNG VON POLY(A) + -RNA . 766 30.6.3 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER RNA . 767 30.7 ISOLIERUNG VON NUDEINSAEUREN UNTER VERWENDUNG VON MAGNETISCHEN PARTIKELN . 767 30.8 LAB-ON-A-CHIP . 767 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 768 31 AUFARBEITUNG UND CHEMISCHE ANALYTIK VON NUDEINSAEUREN . 769 TOBIAS POEHLMANN UND MARION JURK 31.1 VERFAHREN ZUR ANALYTIK VON NUDEINSAEUREN AUS BIOLOGISCHEN PROBEN . 771 31.1.1 ELEKTROPHORESE . 771 31.1.2 FAERBE-UND MARKIERUNGSMETHODEN . 785 31.1.3 BLOTTINGVERFAHREN . 786 31.1.4 RESTRIKTIONSANALYSE . 791 31.2 CHEMISCHE ANALYTIK VON NUDEINSAEUREN . 800 31.2.1 HERSTELLUNG VON OLIGONUCLEOTIDEN . 800 31.2.2 UNTERSUCHUNG DER REINHEIT VON OLIGONUCLEOTIDEN . 804 31.2.3 GEL-ELEKTROPHORESE . 804 XXIII INHALTSVERZEICHNIS 31.2.4 CHARAKTERISIERUNG VON OLIGONUCLEOTIDEN . 806 31.2.5 AUFREINIGUNG VON NUDEINSAEUREN . 808 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 810 32 RNA-STRUKTURAUFKLAERUNG DURCH CHEMISCHE MODIFIKATION . 811 W.-MATTHIAS LEEDER UND H. ULRICH GOERINGER 32.1 GRUNDLAGEN DER RNA-FALTUNG . 813 32.1.1 RNA-PRIMAERSTRUKTUR. 813 32.1.2 RNA-SEKUNDAER-UND TERTIAERSTRUKTUR . 814 32.2 RNA-MODIFIKATIONSREAGENZIEN UND IHRE SPEZIFITAETEN . 817 32.2.1 BASENSPEZIFISCHE MODIFIKATIONSREAGENZIEN . 818 32.2.2 BASENUNABHAENGIGE MODIFIKATIONSREAGENZIEN . 818 32.3 IDENTIFIZIERUNG DER MODIFIZIERTEN NUCLEOTIDPOSITIONEN . 819 32.4 EXPERIMENTELLE DURCHFUEHRUNG . 821 32.4.1 RNA-SYNTHESE UND NOTWENDIGE KONTROLLEN . 821 32.4.2 CHEMISCHE MODIFIKATION . 821 32.4.3 EINBINDUNG DER MODIFIKATIONSDATEN IN 2D-STRUKTURVORHERSAGEN . 822 32.5 TRANSKRIPTOMWEITE STRUKTURAUFKLAERUNGEN . 824 32.6 ERWEITERUNG DER STRUKTURAUFKLAERUNGSMOEGLICHKEITEN DURCH MUTATIONAL PROFILING . 825 32.7 IN VIVO-MODIFIKATIONEN. 826 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 829 33 POLYMERASEKETTENREAKTION . 831 SANDRA NIENDORF UND C.-THOMAS BOCK 33.1 MOEGLICHKEITEN DER PCR . 833 33.2 GRUNDLAGEN . 833 33.2.1 ABLAUF EINER PCR-REAKTION . 833 33.2.2 INSTRUMENTIERUNG . 835 33.2.3 KOMPONENTEN DER PCR-REAKTION . 836 33.2.4 OPTIMIERUNG DER PCR-REAKTION. 838 33.3 SPEZIELLE PCR-TECHNIKEN . 839 33.3.1 QUANTITATIVE PCR . 839 33.3.2 REVERSE-TRANSKRIPTASE-PCR . 842 33.3.3 NESTED-PCR. 844 33.3.4 ASYMMETRISCHE PCR . 845 33.3.5 TOUCHDOWN-PCR . 845 33.3.6 MULTIPLEX-PCR . 845 33.3.7 DIRECT CYCLE SEQUENCING . 846 33.3.8 IN VFTRO-MUTAGENESE . 846 33.3.9 DIGITALE PCR (DPCR; CHAMBER DIGITAL PCR, CDPCR UND DROPLET DIGITAL PCR, DDPCR) . 846 33.3.10 EMULSIONS-PCR (EPCR) . 848 33.3.11 IMMUNQUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR (IPCR, IQPCR, IRTPCR) . 848 33.3.12 INSITU-PCR . 849 33.3.13 WEITERE VERFAHREN . 849 33.4 KONTAMINATIONSPROBLEMATIK . 850 33.4.1 VERMEIDUNG VON KONTAMINATIONEN . 850 33.4.2 DEKONTAMINATION . 851 33.5 ANWENDUNGEN . 852 33.5.1 NACHWEIS VON INFEKTIONSKRANKHEITEN . 852 33.5.2 NACHWEIS VON GENETISCHEN DEFEKTEN . 853 33.5.3 HUMANGENOMPROJEKT . 854 33.6 ALTERNATIVE VERFAHREN DER AMPLIFIKATION . 855 33.6.1 ISOTHERME PCR . 856 33.6.2 LIGASE CHAIN REACTION (LCR) . 860 33.6.3 BRANCHED DNA AMPLIFICATION (BDNA) . 861 XXIV INHALTSVERZEICHNIS 33.7 AUSBLICK . 861 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 862 34 DNA-SEQUENZIERUNG . 863 ANDREA THUERMER UND KILIAN RUTZEN 34.1 GELGESTUETZTE DNA-SEQUENZIERUNGSVERFAHREN. 866 34.1.1 SANGER-SEQUENZIERUNG . 866 34.2 GELFREIE DNA-SEQUENZIERUNGSMETHODEN . 870 34.2.1 NEXT-GENERATION-SEQUENZIERUNG . 870 34.2.2 THIRD-GENERATION-SEQUENZIERUNG . 877 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 882 35 ANALYSE DER EPIGENETISCHEN MODIFIKATIONEN . 885 REINHARD DAMMANN 35.1 UEBERBLICK UEBER DIE DETEKTIONSMETHODEN DER DNA-MODIFIKATIONEN . 887 35.2 ANALYSE DER CYTOSIN-MODIFIKATIONEN MIT DER BISULFITTECHNIK . 887 35.2.1 AMPLIFIKATION UND SEQUENZIERUNG VON BISULFITBEHANDELTER DNA . 889 35.2.2 RESTRIKTIONSANALYSE NACH BISULFIT-PCR . 890 35.2.3 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR . 891 35.3 ANALYSE DER DNA MIT METHYLIERUNGSSPEZIFISCHEN RESTRIKTIONSENZYMEN . 893 35.4 METHYLIERUNGSANALYSE DURCH METHYLCYTOSIN-BINDENDE-DOMAENE-PROTEINE . 895 35.5 ANTIKOERPERSPEZIFISCHE ANALYSEN DER MODIFIZIERTE DNA . 896 35.6 ANALYSE VON MODIFIZIERTEN BASEN DURCH DNA-HYDROLYSE UND NEAREST-NEIGHBOR-ASSAYS 897 35.7 ANALYSE VON EPIGENETISCHEN MODIFIKATIONEN VON CHROMATINASSOZIIERTEN PROTEINEN . 898 35.8 CHROMOSOMENKONFORMATIONSANALYSE . 899 35.9 AUSBLICK . 900 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 900 36 PROTEIN-NUDEINSAEURE-WECHSELW-IRKUNGEN . 901 ROLF WAGNER UND BENEDIKT M. BECKMANN 36.1 GRUNDLAGEN DER PROTEIN-DNA/RNA-WECHSELWIRKUNG: GEMEINSAMKEITEN UND UNTERSCHIEDE . 902 36.1.1 STRUKTUR VON DNA UND RNA . 902 36.1.2 DNA UND RNA-BINDUNGSMOTIVE . 904 36.1.3 GEBRAEUCHLICHE METHODEN ZUR ANALYSE VON NUDEINSAEUREN UND PROTEINEN . 906 36.2 GENERELLE METHODEN (DNA ODER RNA) . 907 36.2.1 FILTERBINDUNG . 907 36.2.2 ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ANALYSIS (EMSA) . 907 36.2.3 CROSSLINKING VON PROTEINEN UND NUDEINSAEUREN . 911 36.3 PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN. 912 36.3.1 DNA-FOOTPRINT-ANALYSEN . 912 36.3.2 PRIMER-EXTENSION-ANALYSE FUER DNA . 913 36.3.3 CHROMATIN-IMMUNPRAEZIPITATION (CHIP) . 914 36.3.4 NUCLEOSOME MAPPING, ASSAY FORTRANSPOSASE-ACCESSIBLE CHROMATIN USING SEQUENCING (ATAC-SEQ) . 915 36.4 PROTEIN-RNA-WECHSELWIRKUNGEN. 916 36.4.1 ANALYSE EINZELNER RBPS . 916 36.4.2 ANALYSE VON PROTEINEN, DIE MIT EINZELNEN RNAS INTERAGIEREN . 919 36.4.3 SYSTEMWEITE ANALYSE VON PROTEINEN, DIE MIT RNA INTERAGIEREN . 920 36.4.4 POLYSOME/RIBOSOME PROFILING . 923 36.5 AUSBLICK . 924 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 924 INHALTSVERZEICHNIS XXV V SYSTEMATISCHE FUNKTIONSANALYTIK 37 SEQUENZANALYSE . 929 BORIS STEIPE 37.1 SEQUENZANALYSE UND BIOINFORMATIK . 930 37.2 DATENBANKEN. 931 37.2.1 SEQUENZABRUF AUS OEFFENTLICHEN DATENBANKEN . 932 37.2.2 DATEN UND DATENFORMAT . 934 37.3 WEBDIENSTE . 934 37.3.1 EMBOSS . 934 37.4 SEQUENZZUSAMMENSETZUNG . 936 37.4.1 SEQUENZTENDENZEN . 937 37.5 MUSTER IN SEQUENZEN . 938 37.5.1 ZEICHENKETTEN UND REGULAER EXPRESSIONS . 939 37.5.2 GEWICHTUNGSMATRIZEN . 939 37.5.3 SEQUENZPROFILE . 940 37.5.4 ANWENDUNGSBEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG CODIERENDER BEREICHE IN DNA . 940 37.5.5 ANWENDUNGSBEISPIEL: PROTEINLOKALISIERUNG . 941 37.6 HOMOLOGIE . 941 37.6.1 IDENTITAET, AEHNLICHKEIT UND HOMOLOGIE . 942 37.6.2 OPTIMALES ALIGNMENT . 943 37.6.3 ALIGNMENT FUER SCHNELLE DATENBANKSUCHEN: BLAST . 944 37.6.4 ORTHOLOGE UND PARALOGE SEQUENZEN . 946 37.6.5 PROFILBASIERTE DATENBANKSUCHEN: PSI-BLAST . 946 37.7 MULTIPLES ALIGNMENT UND KONSENSUSSEQUENZEN . 947 37.8 SEQUENZ UND STRUKTUR . 949 37.9 FUNKTION . 950 37.10 AUSBLICK . 951 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 952 38 HYBRIDISIERUNG FLUORESZENZMARKIERTER DNA ZUR GENOMANALYSE IN DER MOLEKULAREN CYTOGENETIK . 953 GUDRUN GOEHRING, DORIS STEINEMANN, MICHELLE NESSLING UND KARSTEN RICHTER 38.1 METHODEN ZUR HYBRIDISIERUNG FLUORESZENZMARKIERTER DNA. 954 38.1.1 MARKIERUNGSSTRATEGIE . 954 38.1.2 DNA-SONDEN . 955 38.1.3 MARKIERUNG DER DNA-SONDEN . 956 38.1.4 IN SITU-HYBRIDISIERUNG . 956 38.1.5 FLUORESZENZAUSWERTUNG DER HYBRIDISIERUNGSSIGNALE . 957 38.2 ANWENDUNGEN: FISH UND CGH . 957 38.2.1 ANALYSE GENOMISCHER DNA DURCH FISH . 957 38.2.2 VERGLEICHENDE GENOMISCHE HYBRIDISIERUNG (CGH) . 960 38.2.3 SNP-ARRAY . 963 38.2.4 NEUE ENTWICKLUNGEN ZUR DETEKTION VON KOPIENZAHLVERAENDERUNGEN IM GENOM . 963 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 963 39 PHYSIKALISCHE, GENETISCHE UND FUNKTIONELLE KARTIERUNG DES GENOMS . 965 CHRISTIAN MAERCKER 39.1 PHYSIKALISCHE KARTIERUNG. 966 39.2 GENETISCHE KARTIERUNG . 967 39.2.1 REKOMBINATION . 967 39.2.2 GENETISCHE MARKER . 967 39.2.3 KOPPLUNGSANALYSE-DIE ERSTELLUNG GENETISCHER KARTEN . 969 XXVI INHALTSVERZEICHNIS 39.2.4 DIE GENETISCHE KARTE DES MENSCHLICHEN GENOMS . 971 39.2.5 KARTIERUNG VON GENETISCH BEDINGTEN KRANKHEITEN . 972 39.3 FUNKTIONELLE KARTIERUNG DES GENOMS . 973 39.3.1 CHARAKTERISIERUNG VON KRANKHEITSGENEN . 973 39.3.2 MUTATIONEN ALS URSACHE VERERBBARER KRANKHEITEN . 975 39.3.3 TRANSKRIPTKARTEN . 976 39.3.4 ZELLULAERE ASSAYS ZUR CHARAKTERISIERUNG VON GENFUNKTIONEN . 977 39.4 INTEGRATION DER GENOMKARTEN . 979 39.5 DAS MENSCHLICHE GENOM . 979 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 980 40 DNA-MICROARRAY-TECHNOLOGIE . 983 JOERG HOHEISEL 40.1 RNA-ANALYSEN . 984 40.1.1 ANALYSE DERTRANSKRIPTMENGEN . 984 40.1.2 RNA-REIFUNG . 986 40.1.3 RNA-STRUKTUR UND FUNKTIONALITAET . 987 40.2 DNA-ANALYSEN . 987 40.2.1 GENOTYPISIERUNG . 987 40.2.2 EPIGENETISCHE STUDIEN . 987 40.2.3 DNA-SEQUENZIERUNG . 989 40.2.4 ANALYSE DER KOPIENZAHL GENOMISCHER DNA-ABSCHNITTE . 990 40.2.5 PROTEIN-DNA-INTERAKTIONEN . 990 40.2.6 GENOMWEITE IDENTIFIZIERUNG FUNKTIONELL-ESSENZIELLER GENE . 991 40.3 MOLEKUELSYNTHESE . 993 40.3.1 DNA-SYNTHESE. 993 40.3.2 CHIPGEBUNDENE PROTEINEXPRESSION . 993 40.4 NEUE ANSAETZE . 993 40.4.1 EINE UNIVERSELLE CHIP-PLATTFORM . 993 40.4.2 STRUKTURANALYSEN . 994 40.4.3 JENSEITS VON NUDEINSAEUREN . 995 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 995 41 SILENCING-TECHNOLOGIEN ZUR ANALYSE VON GENFUNKTIONEN . 997 JENS KURRECK 41.1 ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDE . 998 41.1.1 WIRKWEISEN VON ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDEN . 999 41.1.2 MODIFIKATIONEN VON OLIGONUCLEOTIDEN ZUR STEIGERUNG DER NUCLEASESTABILITAET . 1000 41.1.3 EINSATZ VON ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDEN IN ZELLKULTUR UND IN TIERMODELLEN . 1002 41.2 RNA-INTERFERENZ UND MICRORNAS . 1003 41.2.1 GRUNDLAGEN DER RNA-INTERFERENZ . 1003 41.2.2 ANWENDUNG DER RNAI-TECHNOLOGIE. 1004 41.2.3 RNA-INTERFERENZ DURCH EXPRESSIONSVEKTOREN . 1005 41.2.4 GENOMWEITE SCREENS MIT RNAI . 1005 41.2.5 MICRORNAS . 1006 41.3 CRISPR/CAS-TECHNOLOGIE . 1007 41.3.1 BIOLOGISCHE FUNKTION DES CRISPR/CAS-SYSTEMS . 1008 41.3.2 CRISPR/CAS-ANWENDUNGEN IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN . 1008 41.4 INDUZIERTE PLURIPOTENTE STAMMZELLEN . 1010 41.5 AUSBLICK . 1011 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1012 42 PROTEOMANALYSE . 1013 FRIEDRICH LOTTSPEICH, KEVIN JOOSS, NEIL L. KELLEHER, MICHAEL GOETZE, BETTY FRIEDRICH UND RUEDI AEBERSOLD 42.1 DEFINITION DER AUSGANGSBEDINGUNGEN UND DER FRAGESTELLUNG, PROJEKTPLANUNG . 1017 INHALTSVERZEICHNIS XXVII 42.2 PROBENVORBEREITUNG. 1018 42.3 QUANTITATIVE ANALYSE DER PROTEINE . 1 020 42.4 KLASSISCHE GELBASIERTE PROTEOMANALYSE . 1 020 42.4.1 PROBENVORBEREITUNG . 1020 42.4.2 TRENNUNG DER PROTEINE . 1020 42.4.3 FAERBUNG DER PROTEINE . 1021 42.4.4 BILDVERARBEITUNG UND QUANTIFIZIERUNG DER PROTEINE, DATENANALYSE. 1021 42.4.5 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PROTEINE . 1022 42.4.6 ZWEIDIMENSIONALE DIFFERENZIELLE GELELEKTROPHORESE (2D-DIGE). 1023 42.5 TOP-DOWN-PROTEOMICS: MASSENSPEKTROMETRIE VON INTAKTEN PROTEINEN . 1024 42.5.1 GRUNDLAGEN INTAKTER PROTEIN-MASSENSPEKTROMETRIE . 1024 42.5.2 DEKONVOLUTION VON PROTEINMASSENSPEKTREN . 1027 42.5.3 FRAGMENTIERUNG VON PROTEINEN . 1029 42.5.4 DATENAUSWERTUNG . 1029 42.5.5 TOP-DOWN-PROTEOMICS IN DER HOCHDURCHSATZANALYSE . 1032 42.5.6 NATIVE TOP-DOWN-MASSENSPEKTROMETRIE . 1034 42.5.7 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK . 1036 42.6 BOTTOM-UP-PROTEOMANALYSE . 1037 42.6.1 BOTTOM-UP-PROTEOMICS . 1037 42.6.2 BOTTOM-UP-STRATEGIEN . 1039 42.6.3 QUANTITATIVE PEPTIDANALYSE . 1041 42.6.4 DATENABHAENGIGE ANALYSE (DDA) . 1041 42.6.5 SELECTED REACTION MONITORING (SRM). 1042 42.6.6 SWATH-MS . 1048 42.6.7 ERWEITERUNGEN . 1050 42.6.8 ZUSAMMENFASSUNG . 1051 42.7 ISOTOPENLABEL-BASIERTE PROTEOMANALYSEN . 1051 42.7.1 ISOTOPENLABELING-STRATEGIEN FUER TOP-DOWN-PROTEOMICS . 1053 42.7.2 ISOTOPENLABELSTRATEGIEN FUER BOTTOM-UP-PROTEOMANALYSEN . 1058 42.7.3 ZUSAMMENFASSUNG . 1061 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1062 43 METABOLOMICS . 1065 CHRISTIAN G. HUBER 43.1 TECHNOLOGISCHE PLATTFORMEN FUER METABOLOMICS . 1068 43.1.1 NMR-BASIERTE METABOLOMICS . 1069 43.1.2 MASSENSPEKTROMETRIE-BASIERTE METABOLOMICS . 1071 43.2 DATENAUSWERTUNG UND BIOLOGISCHE INTERPRETATION . 1074 43.3 METABOLISCHES FINGERPRINTING . 1076 43.4 UNSPEZIFISCHE METABOLOMICS UND METABONOMICS . 1076 43.5 SPEZIFISCHE METABOLOMICS UND METABOLITEN-PROFILING . 1 077 43.6 ANWENDUNGSFELDER . 1079 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1079 44 INTERAKTOMICS - SYSTEMATISCHE ANALYSE VON PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN . 1081 MARKUS F. TEMPLIN, THOMAS O. JOOS, OLIVER POELZ UND DIETER STOLL 44.1 PROTEIN-MICROARRAYS . 1083 44.1.1 SENSITIVITAET DURCH MINIATURISIERUNG - AMBIENT ANALYTE ASSAY . 1084 44.1.2 VON DNA-ZU PROTEIN-MICROARRAYS. 1084 44.1.3 ANWENDUNGEN VON PROTEIN-MICROARRAYS . 1086 44.2 DISKUSSION UND AUSBLICK . 1089 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1090 45 CHEMISCHE BIOLOGIE . 1091 DANIEL RAUH UND SUSANNE BRAKMANN XXVIII INHALTSVERZEICHNIS 45.1 CHEMISCHE BIOLOGIE - INNOVATIVE CHEMISCHE ANSAETZE ZUM STUDIUM BIOLOGISCHER FRAGESTELLUNGEN . 1092 45.2 CHEMISCHE GENETIK - KLEINE ORGANISCHE MOLEKUELE ZUR MODULATION VON PROTEINFUNKTIONEN . 1094 45.2.1 DAS STUDIUM VON PROTEINFUNKTIONEN MIT KLEINEN ORGANISCHEN MOLEKUELEN . 1095 45.2.2 VORWAERTS UND RUECKWAERTS GERICHTETE CHEMISCHE GENETIK . 1097 45.2.3 CHEMO-GENOMISCHE ANSAETZE AM BEISPIEL DER BUMP-AND-HOLE-METHODE . 1098 45.2.4 IDENTIFIZIERUNG VON KINASE-SUBSTRATEN MITHILFE DER ASKA-TECHNOLOGIE. 1102 45.2.5 BIOLOGISCHE SYSTEME MIT KLEINEN ORGANISCHEN MOLEKUELEN SCHALTBAR MACHEN . 1102 45.2.6 MODIFIKATION VON PROTEINEN DURCH ERWEITERUNG DES GENETISCHEN CODES . 1104 45.3 LIGATION EXPRIMIERTER PROTEINE - STUDIUM DER POSTTRANSLATIONALEN MODIFIKATION VON PROTEINEN . 1104 45.3.1 ANALYSE LIPIDIERTER PROTEINE . 1105 45.3.2 ANALYSE PHOSPHORYLIERTER PROTEINE . 1106 45.4 CHEMISCHE BIOLOGIE DER NUDEINSAEUREN . 1107 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1108 46 TOPONOMANALYSE . 1109 WALTER SCHUBERT 46.1 KONZEPT DES PROTEINTOPONOMS . 1111 46.2 IMAGING CYCLER ROBOTS: GRUNDLAGE EINER TOPONOMLESETECHNOLOGIE . 1112 46.3 EIN BEISPIEL: SPEZIFITAET UND SELEKTIVITAET DES ZELLOBERFLAECHENTOPONOMS . 1113 46.4 METHODEN DER TOPONOMANALYSE . 1114 46.4.1 MULTI-EPITOP-LIGAND-KARTOGRAPHIE (MELK) . 1114 46.4.2 PROBENVORBEREITUNG UND ANTIKOERPERKALIBRIERUNG . 1120 46.4.3 WERKZEUGE ZUR VISUALISIERUNG VON TOPONOMDATENSAETZEN . 1121 46.4.4 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG TOPOLOGISCHER MOLEKUELHIERARCHIEN . 1122 46.5 HOCHAUFLOESENDE TOPONOME: BIOMARKER FUER ERFOLGREICHE THERAPIEN. 1123 46.6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK . 1123 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1125 47 ORGAN-ON-CHIP . 1127 PETER LOSKILL UND ALEXANDER MOSIG 47.1 GRUNDLAGEN . 1129 47.1.1 MIKROFLUIDIK . 1129 47.1.2 (BIO-)MATERIALIEN . 1130 47.1.3 ZELLQUELLEN . 1131 47.2 BEISPIELE VON ORGAN-ON-CHIP-SYSTEMEN . 1134 47.2.1 GEWEBE MIT BARRIEREFUNKTION . 1134 47.2.2 GEWEBE MIT STOFFWECHSELFUNKTION . 1135 47.2.3 GEWEBE MIT MECHANISCHER FUNKTION . 1136 47.2.4 NEURONALE GEWEBE . 1136 47.2.5 MULTI-ORGAN-SYSTEME . 1138 47.3 ANALYTISCHE MOEGLICHKEITEN . 1138 47.3.1 IN-CHIP-ANALYSE . 1139 47.3.2 OFF-CHIP-PERFUSATANALYSE . 1140 47.3.3 TERMINALE EX-SITU-ANALYTIK . 1140 47.4 ANWENDUNGSGEBIETE DER OOC-TECHNOLOGIE . 1141 47.4.1 WIRKSAMKEITSTESTUNG . 1141 47.4.2 TOXIKOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN . 1142 47.4.3 PHARMAKOKINETIK . 1142 47.4.4 PERSONALISIERTE MEDIZIN . 1143 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1143 XXIX INHALTSVERZEICHNIS 48 SYSTEMBIOLOGIE . 1145 OLAF WOLKENHAUER UND TOM GEBHARDT 48.1 METHODISCHER URSPRUNG SYSTEMBIOLOGISCHER ANSAETZE . 1146 48.2 DER BEGRIFF DES SYSTEMS UND DESSEN DARSTELLUNG ALS NETZWERK UND GRAPH . 1147 48.2.1 ZELLULAERE FUNKTIONEN, REALISIERT DURCH DIE REGULIERUNG VON PROZESSEN . 1147 48.2.2 DIE BESCHREIBUNG ZELLULAERER MECHANISMEN ALS DYNAMISCHE SYSTEME. 1148 48.3 DIE ROLLE DER MODELLIERUNG IN DER MOLEKULAR UND ZELLBIOLOGIE . 1148 48.3.1 METHODISCHE ANSAETZE. 1149 48.4 DER BEGRIFF DES PATHWAYS UND SEINE GRENZEN . 1150 48.4.1 ABSTRAKTIONEN UND ANNAHMEN ALS GRUNDLAGE ZUR UNTERSUCHUNG KOMPLEXER SYSTEME . 1150 48.4.2 STANDARDS ALS TREIBER FUER AUSTAUSCH UND KOOPERATION . 1151 48.5 ANSAETZE ZUR KONSTRUKTION UND ANALYSE VON MODELLEN . 1151 48.5.1 KONSTRUKTION . 1151 48.5.2 ANALYSE . 1152 LITERATUR UND WEITERFUEHRENDE LITERATUR . 1153 SERVICETEIL STANDARD-AMINOSAEUREN . 1156 NUDEINSAEUREN UND KOHLENHYDRATE . 1157 AUSGEWAEHLTE WICHTIGE LIPIDE . 1158 STICHWORTVERZEICHNIS . 1159
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