Verfügbarkeit: Proteomische Analyse funktioneller Prozesse und metabolischer Stoffwechselwege während der Adipogenese durch Etablierung von SRM-Methoden

Proteomische Analyse funktioneller Prozesse und metabolischer Stoffwechselwege während der Adipogenese durch Etablierung von SRM-Methoden:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Hentschel, Andreas (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Düren Shaker Verlag 2019
Ausgabe:	[1. Auflage]
Schriftenreihe:	Berichte aus der Biologie
Schlagworte:	Adipogenesis SRM mass spectrometry metabolic pathways method development Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	IX, 171 Seiten Illustrationen 21 cm x 14.8 cm, 253 g
ISBN:	9783844068634

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH) ................................................................................................................. III SUMMARY (ENGLISH) .................................................................................................................................. IV ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................................................ VIII 1 EINLEITUNG ...................................................................................................................................... -1 - 1.1 ADIPOZYTEN ............................................................................................................................... - 3 - 1.2 ADIPOGENESE ............................................................................................................................. - 4 - 1.3 DER MASTERREGULATOR PPARY ................................................................................................... - 6 - 1.4 DYSREGULATION DER ADIPOGENESE FUHRT ZU SCHWERWIEGENDEN KRANKHEITEN ............................. - 9 - 1.5 MODIFIZIERUNG VON PROTEINEN DURCH LIPIDE ......................................................................... -11 - 1.6 MODELSYSTEM - MURINE, MESENCHYMALE STAMMZELLEN (OP9 ZELLLINIE) .............................. -14 - 1.7 PRINZIPIEN DER PROTEOMIK ...................................................................................................... -15 - 1.7.1 ANALYSE DES PROTEOMS DURCH MASSENSPEKTROMETRIE .................................................... -17 - 1.7.2 IONISIERUNG DURCH ELEKTROSPRAY ..................................................................................... - 20 - 1.7.3 UMKEHRPHASENCHROMATOGRAPHIE .................................................................................. - 22 - 1.7.4 TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE ..................................................................................... - 23 - 1.7.5 QUANTIFIZIERUNGSSTRATEGIEN VON PROTEINEN DURCH MASSENSPEKTROMETRIE .................... - 24 - 1.7.5.1 MARKIERUNGSFREIE MASSENSPEKTROMETRISCHE PROTEIN QUANTIFIZIERUNG .................... - 25 - 1.7.5.2 PROTEIN-QUANTIFIZIERUNG DURCH ZIELGERICHTETE MASSENSPEKTROMETRIE ..................... - 27 - 1.7.6 AUSWERTUNG VON MASSENSPEKTROMETRISEHEN DATEN ....................................................... - 30 - 1.8 FLUORESZENZMIKROSKOPIE ...................................................................................................... - 31 - 1.9 SIRNA ALS WERKZEUG FUER DIE PROTEOMFORSCHUNG ................................................................ - 32 - 2 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT ........................................................................................................... - 35 - 2.1 GRAPHISCHE ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................. - 36 - 3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................................. - 37 - 3.1 MATERIALIEN ............................................................................................................................ -37- 3.1.1 REAGENZIEN .................................................................................................................... - 37 - 3.1.2 ANTIKOERPER UND FLUORESZENZFARBSTOFFE .......................................................................... - 37 - 3.1.3 INSTRUMENTE UND VERBRAUCHSMATERIAL ............................................................................ - 38 - 3.1.4 DATENANALYSESOFTWARE ................................................................................................... - 38 - 3.2 METHODEN ................................................................................................................................. - 39 - 3.2.1 ZELLKULTUR ........................................................................................................................ -39- 3.2.1.1 PROPAGIERUNG DER OP9 ZELLEN .................................................................................. - 39 - 3.2.1.2 KONTROLL- UND ZEITAUFGELOESTE DIFFERENZIERUNG VON OP9 ZELLEN ZU ADIPOCYTEN.... - 39 - SEITE \| V 3.2.1.3 KONTROLL-DIFFERENZIERUNG VON OP9 ZELLEN ZU ADIPOCYTEN IN 96- ^//-PLATTEN ...... - 40 - 3.2.1.4 BEHANDLUNG VON OP9 ZELLEN MIT METFORMIN WAEHREND DER DIFFERENZIERUNG ......... - 41 - 3.2.1.5 EINZELZELL BILDANALYSE .............................................................................................. - 41 - 3.2.2 BIOCHEMISCHE METHODEN .............................................................................................. - 42 - 3.2.2.1 BESCHICHTUNG VON 96 -WELL PLATTEN FUER FLUORESZENZMIKROSKOPIE ........................... - 42 - 3.2.2.2 FAERBUNG VON PPARY UND LIPID-TROEPFCHEN IN ZELLKULTUR ....................................... - 42 - 3.2.3 PROBENVORBEREITUNG ....................................................................................................... - 43 - 3.2.3.1 FRAKTIONIERTE PROTEIN EXTRAKTION ............................................................................... - 43 - 3.2.3.2 QUALITAETS- UND VERDAUKONTROLLE ............................................................................... - 45 - 3.2.3.3 PROBENVORBEREITUNG VON UNTERSCHIEDLICHEN ORGANEN UND GEWEBEN ...................... - 46 - 3.2.3.4 PH 8 UMKEHRPHASEN-FRAKTIONIERUNG ....................................................................... - 46 - 3.2.4 ERFASSUNG UND ANALYSE VON MARKIERUNGSFREIEN NANO LC-ESI-MS DATEN ................... - 47 - 3.2.4.1 MARKIERUNGSFREIE MESSUNG DER DIFFERENZIERUNGSZEITKURVE .................................... - 47 - 3.2.4.2 PROTEINIDENTIFIKATION, -QUANTIFIKATION UND DATENANALYSE ...................................... - 47 - 3.2.5 ANREICHERUNGSKONTROLLE DER SUBZELLULAEREN FRAKTIONIERUNG .......................................... - 49 - 3.2.6 GO-TERM ANALYSE ......................................................................................................... -49- 3.2.7 ANALYSE VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN ........................................................................... - 49 - 3.2.8 TARGETED LC-MS/MS ANALYSIS ...................................................................................... - 51 - 3.2.9 SYNTHESE VON ISOTOPENMARKIERTEN PEPTIDEN (SIL) ....................................................... - 52 - 3.2.10 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG MIT SIL-STANDARDPEPTIDEN .................................................. - 52 - 3.3 AUFBAU UND ERSTELLUNG VON VORONOI DIAGRAMMEN ............................................................. - 53 - 3.4 REDUKTION DER EXPRESSION DURCH SIRNA ............................................................................ - 53 - 3.5 STATISTIK .................................................................................................................................. -54- 3.5.1 ANALYSE DER MARKIERUNGSFREIEN LC-MS/MS DATEN .................................................... - 54 - 3.5.1.1 VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON FEHLENDEN WERTEN ............................................... - 55 - 3.5.2 ANALYSE DER ZIELGERICHTETEN LC-MS/MS DATEN .......................................................... - 55 - 3.5.2.1 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG UND BESTIMMUNG DES LLOQ ........................................ - 56 - 3.6 BESCHREIBUNG ZUSAETZLICH VERWENDETER SOFTWARE UND DATENBANKEN ................................... - 57 - 4 ERGEBNISSE ..................................................................................................................................... -58- 4.1 DIFFERENZIERUNG VON OP9 ZELLEN ZU ADIPOZYTEN ................................................................. - 58 - 4.1.1 KONTROLLDIFFERENZIERUNG MIT ROSIGLITAZON .................................................................. - 59 - 4.1.2 AUFNAHME DER ADIPOGENESE ZU VERSCHIEDENEN ZEITPUNKTEN ..................................... - 60 - 4.2 UNTERSUCHUNG UND ANALYSE DER ADIPOGENESE AUF PROTEOMISCHER EBENE ........................... - 62 - 4.2.1 KONTROLLE UND EFFIZIENZ DER SUBZELLULAEREN FRAKTIONIERUNG ........................................ - 62 - 4.2.2 DARSTELLUNG DES PROTEOMISCHEN SYSTEMS .................................................................... - 64 - SEITE \| VI 4.2.3 VISUALISIERUNG DER DYNAMIK DES PROTEOMS IM LAUFE DER ADIPOGENESE ................... - 67 4.2.4 GO-TERM ANALYSE DER ADIPOGENESE ......................................................................... - 79 4.2.5 ANALYSE REGULIERTER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN ................................................................ - 80 4.2.6 REGULATION METABOLISCHER STOFFWECHSELWEGE WAEHREND DER ADIPOGENESE ................ - 83 4.2.7 ERSTELLUNG EINER DATENBANK ZUR ENTWICKLUNG VON ZIELGERICHTETEN MS-METHODEN .... - 90 4.3 AUFBAU VON * SCHEDULED SRM * METHODEN UND OPTIMIERUNG VON KOLLISIONSENERGIEN ....... - 92 4.3.1 ZIELGERICHTETE MS-ANALYSE VON STOFFWECHSEL WEGEN WAEHREND DER ADIPOGENESE ...... - 94 4.3.2 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG AUSGEWAEHLTER PROTEINE WAEHREND DER ADIPOGENESE .......... - 98 4.3.3 GLYKOLYSE ABSOLUT QUANTIFIZIERT ................................................................................. -104 4.4 FUNKTIONELLE ANALYSE VON FETTZELLEN DURCH FLUORESZENZMIKROSKOPIE ............................. -107 4.5 FUNKTIONELLE ANALYSE DER GLUKONEOGENESE DURCH PPARY-KNOCKDOWN ........................... -110 5 DISKUSSION ................................................................................................................................... -112- 5.1 OP9 ZELLEN UND IHRE ANWENDUNG ZUM STUDIUM DER ADIPOGENESE .................................. -113 - 5.2 ZEITAUFLOESUNG UND SUBFRAKTIONIERUNG - START EINER GLOBALEN CHARAKTERISIERUNG ............. -114 - 5.3 DIE DYNAMISCHE VERAENDERUNG DES PROTEOMS WAEHREND DER ADIPOGENESE ........................ -115 - 5.4 GEN-ONTOLOGIE ANALYSE ...................................................................................................... -117- 5.5 DYNAMIK FUNKTIONELLER PROZESSE WAEHREND DER ADIPOGENESE ............................................ -118 - 5.5.1 TRANSLATION UND TRANSKRIPTION - SYNTHESE NEUER PROTEINE ........................................ -118 - 5.5.2 ENERGIESTOFFWECHSEL UND BIOSYNTHESE - EINE ZELLE SPEZIALISIERT SICH ....................... -120 - 5.5.3 SIGNALTRANSDUKTION - REGULIERUNG DES METABOLISMUS ............................................... -122 - 5.5.4 ENDOKRINES SYSTEM - KONTROLLE METABOLISCHER HOMOEOSTASE DURCH ADIPOZYTEN ..... -124 - 5.6 DYNAMISCHE REGULIERUNG METABOLISCHER STOFFWECHSELWEGE ........................................... -125 - 5.6.1 ETABLIERUNG EINER DATENBANK ZUR GEZIELTEN ANALYSE VON STOFFWECHSELWEGEN .......... -125 - 5.6.2 DYNAMISCHER REGULATION DES METABOLISMUS WAEHREND DER ADIPOGENESE .................. -126 - 5.7 GLUKONEOGENESE - EIN NEUER METABOLISCHER FEEDBACK MIT PPARY? ............................... -131 - 5.8 TRANSKRIPTIONSFAKTOR-REGULATION - KONTROLLE DES CHROMATINUMBAUS ............................. -133 - 6 AUSBLICK ...................................................................................................................................... -135- 7 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................................. -138- 8 DANKSAGUNGEN ........................................................................................................................... -157 - 9 LEBENSLAUF .................................................................................................................................. -158- 10 ANHANG ....................................................................................................................................... -159- SEITE \| VII
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH) . III SUMMARY (ENGLISH) . IV ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . VIII 1 EINLEITUNG . -1 - 1.1 ADIPOZYTEN . - 3 - 1.2 ADIPOGENESE . - 4 - 1.3 DER MASTERREGULATOR PPARY . - 6 - 1.4 DYSREGULATION DER ADIPOGENESE FUHRT ZU SCHWERWIEGENDEN KRANKHEITEN . - 9 - 1.5 MODIFIZIERUNG VON PROTEINEN DURCH LIPIDE . -11 - 1.6 MODELSYSTEM - MURINE, MESENCHYMALE STAMMZELLEN (OP9 ZELLLINIE) . -14 - 1.7 PRINZIPIEN DER PROTEOMIK . -15 - 1.7.1 ANALYSE DES PROTEOMS DURCH MASSENSPEKTROMETRIE . -17 - 1.7.2 IONISIERUNG DURCH ELEKTROSPRAY . - 20 - 1.7.3 UMKEHRPHASENCHROMATOGRAPHIE . - 22 - 1.7.4 TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE . - 23 - 1.7.5 QUANTIFIZIERUNGSSTRATEGIEN VON PROTEINEN DURCH MASSENSPEKTROMETRIE . - 24 - 1.7.5.1 MARKIERUNGSFREIE MASSENSPEKTROMETRISCHE PROTEIN QUANTIFIZIERUNG . - 25 - 1.7.5.2 PROTEIN-QUANTIFIZIERUNG DURCH ZIELGERICHTETE MASSENSPEKTROMETRIE . - 27 - 1.7.6 AUSWERTUNG VON MASSENSPEKTROMETRISEHEN DATEN . - 30 - 1.8 FLUORESZENZMIKROSKOPIE . - 31 - 1.9 SIRNA ALS WERKZEUG FUER DIE PROTEOMFORSCHUNG . - 32 - 2 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT . - 35 - 2.1 GRAPHISCHE ZUSAMMENFASSUNG . - 36 - 3 MATERIAL UND METHODEN . - 37 - 3.1 MATERIALIEN . -37- 3.1.1 REAGENZIEN . - 37 - 3.1.2 ANTIKOERPER UND FLUORESZENZFARBSTOFFE . - 37 - 3.1.3 INSTRUMENTE UND VERBRAUCHSMATERIAL . - 38 - 3.1.4 DATENANALYSESOFTWARE . - 38 - 3.2 METHODEN . - 39 - 3.2.1 ZELLKULTUR . -39- 3.2.1.1 PROPAGIERUNG DER OP9 ZELLEN . - 39 - 3.2.1.2 KONTROLL- UND ZEITAUFGELOESTE DIFFERENZIERUNG VON OP9 ZELLEN ZU ADIPOCYTEN. - 39 - SEITE \| V 3.2.1.3 KONTROLL-DIFFERENZIERUNG VON OP9 ZELLEN ZU ADIPOCYTEN IN 96- ^//-PLATTEN . - 40 - 3.2.1.4 BEHANDLUNG VON OP9 ZELLEN MIT METFORMIN WAEHREND DER DIFFERENZIERUNG . - 41 - 3.2.1.5 EINZELZELL BILDANALYSE . - 41 - 3.2.2 BIOCHEMISCHE METHODEN . - 42 - 3.2.2.1 BESCHICHTUNG VON 96 -WELL PLATTEN FUER FLUORESZENZMIKROSKOPIE . - 42 - 3.2.2.2 FAERBUNG VON PPARY UND LIPID-TROEPFCHEN IN ZELLKULTUR . - 42 - 3.2.3 PROBENVORBEREITUNG . - 43 - 3.2.3.1 FRAKTIONIERTE PROTEIN EXTRAKTION . - 43 - 3.2.3.2 QUALITAETS- UND VERDAUKONTROLLE . - 45 - 3.2.3.3 PROBENVORBEREITUNG VON UNTERSCHIEDLICHEN ORGANEN UND GEWEBEN . - 46 - 3.2.3.4 PH 8 UMKEHRPHASEN-FRAKTIONIERUNG . - 46 - 3.2.4 ERFASSUNG UND ANALYSE VON MARKIERUNGSFREIEN NANO LC-ESI-MS DATEN . - 47 - 3.2.4.1 MARKIERUNGSFREIE MESSUNG DER DIFFERENZIERUNGSZEITKURVE . - 47 - 3.2.4.2 PROTEINIDENTIFIKATION, -QUANTIFIKATION UND DATENANALYSE . - 47 - 3.2.5 ANREICHERUNGSKONTROLLE DER SUBZELLULAEREN FRAKTIONIERUNG . - 49 - 3.2.6 GO-TERM ANALYSE . -49- 3.2.7 ANALYSE VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN . - 49 - 3.2.8 TARGETED LC-MS/MS ANALYSIS . - 51 - 3.2.9 SYNTHESE VON ISOTOPENMARKIERTEN PEPTIDEN (SIL) . - 52 - 3.2.10 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG MIT SIL-STANDARDPEPTIDEN . - 52 - 3.3 AUFBAU UND ERSTELLUNG VON VORONOI DIAGRAMMEN . - 53 - 3.4 REDUKTION DER EXPRESSION DURCH SIRNA . - 53 - 3.5 STATISTIK . -54- 3.5.1 ANALYSE DER MARKIERUNGSFREIEN LC-MS/MS DATEN . - 54 - 3.5.1.1 VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON FEHLENDEN WERTEN . - 55 - 3.5.2 ANALYSE DER ZIELGERICHTETEN LC-MS/MS DATEN . - 55 - 3.5.2.1 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG UND BESTIMMUNG DES LLOQ . - 56 - 3.6 BESCHREIBUNG ZUSAETZLICH VERWENDETER SOFTWARE UND DATENBANKEN . - 57 - 4 ERGEBNISSE . -58- 4.1 DIFFERENZIERUNG VON OP9 ZELLEN ZU ADIPOZYTEN . - 58 - 4.1.1 KONTROLLDIFFERENZIERUNG MIT ROSIGLITAZON . - 59 - 4.1.2 AUFNAHME DER ADIPOGENESE ZU VERSCHIEDENEN ZEITPUNKTEN . - 60 - 4.2 UNTERSUCHUNG UND ANALYSE DER ADIPOGENESE AUF PROTEOMISCHER EBENE . - 62 - 4.2.1 KONTROLLE UND EFFIZIENZ DER SUBZELLULAEREN FRAKTIONIERUNG . - 62 - 4.2.2 DARSTELLUNG DES PROTEOMISCHEN SYSTEMS . - 64 - SEITE \| VI 4.2.3 VISUALISIERUNG DER DYNAMIK DES PROTEOMS IM LAUFE DER ADIPOGENESE . - 67 4.2.4 GO-TERM ANALYSE DER ADIPOGENESE . - 79 4.2.5 ANALYSE REGULIERTER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN . - 80 4.2.6 REGULATION METABOLISCHER STOFFWECHSELWEGE WAEHREND DER ADIPOGENESE . - 83 4.2.7 ERSTELLUNG EINER DATENBANK ZUR ENTWICKLUNG VON ZIELGERICHTETEN MS-METHODEN . - 90 4.3 AUFBAU VON * SCHEDULED SRM * METHODEN UND OPTIMIERUNG VON KOLLISIONSENERGIEN . - 92 4.3.1 ZIELGERICHTETE MS-ANALYSE VON STOFFWECHSEL WEGEN WAEHREND DER ADIPOGENESE . - 94 4.3.2 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG AUSGEWAEHLTER PROTEINE WAEHREND DER ADIPOGENESE . - 98 4.3.3 GLYKOLYSE ABSOLUT QUANTIFIZIERT . -104 4.4 FUNKTIONELLE ANALYSE VON FETTZELLEN DURCH FLUORESZENZMIKROSKOPIE . -107 4.5 FUNKTIONELLE ANALYSE DER GLUKONEOGENESE DURCH PPARY-KNOCKDOWN . -110 5 DISKUSSION . -112- 5.1 OP9 ZELLEN UND IHRE ANWENDUNG ZUM STUDIUM DER ADIPOGENESE . -113 - 5.2 ZEITAUFLOESUNG UND SUBFRAKTIONIERUNG - START EINER GLOBALEN CHARAKTERISIERUNG . -114 - 5.3 DIE DYNAMISCHE VERAENDERUNG DES PROTEOMS WAEHREND DER ADIPOGENESE . -115 - 5.4 GEN-ONTOLOGIE ANALYSE . -117- 5.5 DYNAMIK FUNKTIONELLER PROZESSE WAEHREND DER ADIPOGENESE . -118 - 5.5.1 TRANSLATION UND TRANSKRIPTION - SYNTHESE NEUER PROTEINE . -118 - 5.5.2 ENERGIESTOFFWECHSEL UND BIOSYNTHESE - EINE ZELLE SPEZIALISIERT SICH . -120 - 5.5.3 SIGNALTRANSDUKTION - REGULIERUNG DES METABOLISMUS . -122 - 5.5.4 ENDOKRINES SYSTEM - KONTROLLE METABOLISCHER HOMOEOSTASE DURCH ADIPOZYTEN . -124 - 5.6 DYNAMISCHE REGULIERUNG METABOLISCHER STOFFWECHSELWEGE . -125 - 5.6.1 ETABLIERUNG EINER DATENBANK ZUR GEZIELTEN ANALYSE VON STOFFWECHSELWEGEN . -125 - 5.6.2 DYNAMISCHER REGULATION DES METABOLISMUS WAEHREND DER ADIPOGENESE . -126 - 5.7 GLUKONEOGENESE - EIN NEUER METABOLISCHER FEEDBACK MIT PPARY? . -131 - 5.8 TRANSKRIPTIONSFAKTOR-REGULATION - KONTROLLE DES CHROMATINUMBAUS . -133 - 6 AUSBLICK . -135- 7 LITERATURVERZEICHNIS . -138- 8 DANKSAGUNGEN . -157 - 9 LEBENSLAUF . -158- 10 ANHANG . -159- SEITE \| VII
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