Lokalisation der Sortingdomäne in dem neuronal-vesikulären Carrier SLC10A4:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
DVG Service GmbH
[2019]
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| Ausgabe: | 1. Auflage |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | X, 96 Seiten Illustrationen, Diagramme |
| ISBN: | 9783863454951 |
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| adam_text | Aus dem Institut Tür Pharmakologie und Toxikologie,
Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
Betreuer: Prof Dr Joachim Geyer
Lokalisation der Sortingdomäne in dem
neuronal-vesikulären Carrier SLC10A4
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Dr med vet
beim Fachbereich Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Eingereicht von
Marcela H Moncada Ulloa
Tierärztin aus Pitrufquen, Chile
Gießen 2018
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1 1 Die Familie SLC10, ein Überblick I
1 2 Die funktionell charakterisierten SLCIO-Mitglieder: NTCP, ASBT und SOAT 4
121 NTCP (SLCI0A1) 4
122 ASBT (SLC10A2) 5
123 SOAT (SLCI0A6) 6
1 3 Der Orphan Carrier SLC10A4 7
1 4 SLC 10A4 und NTCP 10
1 5 Zielsetzung 11
2 Material 12
2 1 Materialien für die Molekularbiologie 12
211 Verwendete Primer 12
212 Verwendete Enzyme 14
213 Verwendete Vektoren 15
214 Verwendete Bakterienstämme 20
215 Längenstandards filr Agarosegelelektrophorese 20
216 Kommerziell erhältliche Kits 20
217 Antibiotika 21
218 PulTer und Medien 21
2 2 Agarose-Gelelektrophorese 22
2 3 Zellkultur 22
231 Zelllinien 22
232 Medien und Lösungen für die Zellkultur 23
233 Antibiotika und Zusätze ftir die Zellkultur 24
I
2 4 Stabile und transiente Transfektion
241 Transfektionsreagenzien
242 Kulturmedien und Puffer für die Transfektion und Elektroporation 25
2 5 Transportmessungen an eukaryotischen Zellen 25
251 Puffer und Lösungen 25
252 Proteinbestimmung 26
2 6 Immunfluoreszenz 26
261 Puffer und Lösungen 26
2 7 Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe 27
2 8 Reagenzien und radioaktiv-markierte Stoffe 28
281 Reagenzien ^
2Q
282 Radioaktiv-markierte Substanzen
2 9 Geräte ^
31
2 10 Verbrauchsmaterial
32
2 11 Verwendete bioinformatische Programme
34
3 Methoden
, , 34
3 1 Allgemeine molekularbiologische Methoden
34
311 Eihanoipräzipitation von Nukleinsäuren ^
312 Konzentrationsbestimmung von DNA ^
313 Aufreinigung von PCR-Amplifikaten ^
314 Native Agarose-Gelelektrophorese ^
315 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
316 DNA-Spaltung durch Restriktionsenzyme ^
317 Isolierung von Plasmid-DNA im Mini-Maßstab
II
318 Isolierung von Plasmid-DNA im Midi-Maßstab,
37
3 2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38
321 Primerauswahl 38
322 PCR-Reaktionsansatz 38
323 Touchdown-PCR 39
324 Zielgerichtete Mutagenese und gezielte Deletion in Plasmiden 39
3 3 Klonierung 42
331 Klonierung über Restriktionsenzyme 42
332 TOPO-TA Klonierung 43
333 Klonierung über das Gateway System 43
3 4 Kultivierung eukaryotischer Zellen 45
341 Passagieren und Aussäen der Zellen 45
342 Einfrieren und Auftauen der Zellen 46
3 5 Transfektion eukaryotischer Zellen 46
351 Stabile Transfektion 47
352 Transiente Transfektion mit kationischen Lipiden 48
353 Transfektion der SH-SY5Y Zelllinie 49
354 Eleklroporation der SH-SY5Y Zelllinie 49
3 6 Transportmessung an eukaryotischen Zellen 50
361 Ansetzen der Messlösung 51
362 Vorbereitung der Zellen und Aufnahmemessung 51
363 Proteinbestimmung und Flüssigszintillationsmessung 51
364 Auswertung der Aufnahmeversuche 52
3 7 Fluoreszenz 52
III
371 Immunfluoreszenz
372 Indirekte Immunfluoreszenz an transient transfizierten CAD und an
transfizierten Fln-In T-REx 293 Zellen
373 Direkte Fluoreszenz mit den EmGFP-, ECFP-, EYFP- und pTagRFP-marki^
Konstrukten
54
4 Ergebnisse 22
4 1 Generierung von SLCI0A4/NTCP-Cliimären und 75ASLC10A4-Mutante 55
411 Expression von 75ASLC10A4-Mutante in den Zelllinien CAD und HEK293 59
412 Nachweis der transient transfizierten SLC10A4/NTCP-Chimären in CAD Zellen
mittels Immunfluoreszenz 60
413 Erstellung stabil transfizierter HEK293 Zellen 62
414 Untersuchung der stabil transfizierten Chimären mittels Immunfluoreszenz 62
415 Doppelmarkierung mit dem Plasmamembranmarker Pan-Cadherin 64
4 2 Transportversuche mit den SLCI0A4/NTCP-Chimären und der 75ASLC10A4-
Mutante in Säugerzellen ^5
421 Transportmessungen mit den stabil transfizierten Chimären in HEK293 Zellen 65
422 Untersuchung des Gallensäure-Transports über die Chimären und die Mutante in
CAD Zellen 67
423 Transportuntersuchungen mit Taurocholat und Steroidsulfaten in transient
„ „68
transfizierten HEK293 Zellen
4 3 Native Expression des Slcl0a4-Pro(eins in CAD Zellen
4 4 Transfcktion der neuronalen SH-SY5Y Zelllinie
70
441 Etablierung einer geeigneten Transfektionsmethode ^
442 Coiokalisation von SLC10A4 und VAChT in SH-SY5Y Zellen
4 5 Intcraktionspartner von SLC10A4
72
5 Diskussion
75
IV
5 1 SLC10A4 und NTCP
75
511 Membrantopologie von SLC10A4 und NTCP 75
5 2 Lokalisation der Sorlingdomäne von SLC10A4 76
521 Untersuchung derN- und C-terminalen Domänen des SLCI0A4 mittels Mutante
und Chimären 76
522 Sortingmotive 77
5 3 SLC10A4 und seine Lokalisation in synaptischen Vesikeln 78
531 Sequenzen im C-Terminus sind am vesikulären Sorting beteiligt 80
532 Tyrosin-Sortingmolive im C-Terminus von SLC10A4 81
5 4 Vorbereitung von CFP- und YFP-gekoppeltcn Konstrukten von SLC10A4, VAChT
und VMAT2 für FRET-Studicn 82
541 Auf dem Weg zu Protein-Protein-Interaktionen und Oligomerisierung 82
6 Zusammenfassung 84
7 Summary 85
8 Literaturverzeichnis 86
9 Danksagungen 95
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