Charakterisierung des CD22 und Siglec-G Interaktoms, sowie die Rolle von Siglecs in der Keimzentrumsreaktion:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Erlangen ; Nürnberg
[2019]
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | V, 192 Seiten Illustrationen, Diagramme 21 cm |
Internformat
MARC
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1.
ZUSAMMENFASSUNG
...................................................................................................
1
2.
SUMMARY
..................................................................................................................
3
3.
EINLEITUNG
..................................................................................................................
5
3.1.
B-ZELLEN
............................................................................................................................................
5
3.2.
B-ZELL
REZEPTOR
SIGNALTRANSDUKTION
...............................................................................................
5
3.3.
DIE
KEIMZENTRUMSREAKTION
UND
AUSBILDUNG
EINES
IMMUNOLOGISCHEN
B-ZELL
GEDAECHTNISSES ....7
3.4.
SIGLECS
............................................................................................................................................
13
3.4.1.
EINTEILUNG
UND
AUFBAU
VON
SIGLECS
.......................................................................................
13
3.4.2.
CD22
.......................................................................................................................................
14
3.4.2.1.
AUFBAU
UND
EXPRESSION
VON
CD22
................................................................................
14
3.4.2.2.
FUNKTION
UND
WIRKUNGSWEISE
VON
CD22
.......................................................................
15
3.4.3.
SIGLEC-G
..................................
17
3.4.3.1.
AUFBAU
UND
EXPRESSION
VON
SIGLEC-G
...........................................................................
17
3.4.3.2.
FUNKTION
UND
WIRKUNGSWEISE
VON
SIGLEC-G
..................................................................
17
3.5.
NEU
IDENTIFIZIERTE
CD22
INTERAKTIONSPARTNER
................................................................................
19
3.5.1.
SERCA2
..................................................................................................................................
19
3.5.2.
RHOH
.......................................................................................................................................
21
3.5.3.
BCAP
UND
PI3K
SIGNALTRANSDUKTION
.....................................................................................
22
3.5.4.
GUILIN
3
UND
UBIQUITINILIERUNG
................................................................................................
24
3.5.5.
KLHL6
.....................................................................................................................................
27
4.
ZIELSETZUNG
............................................................................................................
28
5.
MATERIALIEN
.............................................................................................................
29
5.1.
VERWENDETE
ZELLLINIEN
....................................................................................................................
29
5.2.
SUBSTANZEN
FUER
DIE
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
.........................................................................
30
5.3.
ANTIKOERPER
UND
KONJUGATE
............................................................................................................
30
5.4.
CHEMIKALIEN
UND
LABORMATERIAL
...................................................................................................
35
5.5.
KOMMERZIELLE
KITS
.........................................................................................................................
38
5.6.
MEDIEN,
LOESUNGEN
UND
PUFFER
......................................................................................................
38
5.7.
GERAETE
............................................................................................................................................
44
5.8.
SOFTWARE
.........................................................................................................................................
45
5.9.
OLIGONUKLEOTIDE
.............................................................................................................................
45
6.
METHODEN
..............................................................................................................
47
6.1.
ALLGEMEINE
METHODEN
...................................................................................................................47
6.1.1.
BESTIMMUNG
DER
LEBENDZELLZAHL
MITTELS
TRYPANBLAUFAERBUNG
.............................................47
6.1.1.
ZENTRIFUGATION
UND
LAGERUNG
VON
ZELLEN
..............................................................................
47
6.2.
ARBEITEN
MIT
MAEUSEN
.....................................................................................................................
47
6.2.1.
VERWENDETE
MAUSSTAEMME
....................................................................................................
47
6.2.2.
ORGAN
PRAEPARATION
UND
AUFARBEITUNG
MURINER
ZELLEN
..........................................................
48
6.2.3.
INJEKTION
VON
MAEUSEN
............................................................................................................
49
6.2.3.1.
INTRAPERITONEALE
INJEKTION
VON
SCHAFSERYTHROZYTEN
.......................................................
49
6.2.3.2.
INTRAPERITONEALE
INJEKTION
VON
NP-KLH
..........................................................................
49
6.2.3.3.
INTRAVENOESE
INJEKTION
.....................................................................................................
49
6.2.4.
GENERIERUNG
VON
KNOCHENMARKSCHIMAEREN
..........................................................................
49
6.2.5.
BLUTENTNAHME
..........................................................................................................................
50
6.3.
AUFREINIGUNG
VON
B
-ZELL
POPULATIONEN
.........................................................................................
50
6.3.1.
KOMPLEMENT
VERMITTELTE
T-ZELL
LYSE
.....................................................................................
51
6.3.2.
ZELLSORTIERUNG
MITTELS
MAGNETISCHER
BEADS
(MACS)
............................................................
51
6.3.3.
ZELL
SORTIERUNG
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
........................................................................
51
6.4.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
................................................................................................
52
6.4.1.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
VON
ZELLOBERFLAECHEN-MARKEN
.........................................
52
6.4.2.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
VON
INTRAZELLULAEREN
MARKERN
..........................................
52
6.4.3.
DUCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
VON
PHOSPHOPROTEINEN
...................................................
52
6.4.4.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
VON
AKTIVER
CASPASE-3
..................................................
53
6.4.5.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
MESSUNG
DES
CALCIUMEINSTROMS
UEBER
DIE
PLASMAMEMBRAN
....
54
6.4.6.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
MESSUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
CALCIUMEINSTROMS
AUS
DEM
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUM
DURCH
THAPSIGARGIN
ZUGABE
............................................................
55
6.4.7.
BERECHNUNG
DER
ABSOLUT-ZELLZAHL
EINER
POPULATION
NACH
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER
ANALYSE
..................................................................................................................................................
55
6.5.
METHODEN
DER
ZELLKULTUR
................................................................................................................
56
6.5.1.
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
.......................................................................................
56
6.5.2.
KULTIVIEREN
VON
ZELLLINIEN
.......................................................................................................
56
6.5.3.
SILAC
MARKIERUNG
DER
DT40
ZELLLINIE
FUER
MASSENSPEKTROMETRISCHE
ANALYSEN
................
57
6.5.4.
RETROVIRALE
TRANSDUKTION
UND
SELEKTION
...............................................................................
57
6.5.4.1.
TRANSFEKTION
VON
PLAT-E
ZELLLINIE
ZUR
PRODUKTION
VON
VIREN
.........................................
57
6.5.4.2.
S2
TRANSFEKTION
VON
PLAT-E
ZELLLINIE
ZUR
PRODUKTION
VON
VIREN
...................................
58
6.5.4.3.
TRANSDUKTION
VON
ZELLLINIEN
MITTELS
RETROVIRALEM
UEBERSTAND
.......................................
58
6.6.
ARBEITEN
MIT
PRIMAEREN
ZELLEN
EX
VIVO
............................................................................................
59
6.6.1.
HUNGERN
VON
ZELLEN
................................................................................................................
59
6.6.2.
STIMULATION
VON
B-ZELLEN
.......................................................................................................
59
6.6.3.
CULLIN
INHIBITOR
BEHANDLUNG
...................................................................................................
59
6.6.4.
CD22
INTERNALISIERUNGS-ASSAY
NACH
CULLIN
INHIBITOR
BEHANDLUNG
.......................................
59
6.6.5. CD22
INTERNALISIERUNGS-ASSAY
VON
CUL3
FL/FL
X
MB1
CRE/+
MAEUSEN
............................................
60
6.6.6.
DURCH
ANTI-CD22
ANTIKOERPER
VERMITTELTER
ENDOZYTOSE-ASSAY
.............................................
60
6.7.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
....................................
61
6.7.1.
HERSTELLUNG
VON
ZELLLYSATEN
..................................................................................................
61
6.7.2.
CD22
IMMUNPRAEZIPITATION
.....................................................................................................
61
6.7.3.
AFFINITAETSAUFREINIGUNG
UEBER
DEN
TWIN-STREP-TAG
...................................................................
62
6.7.4.
GIESSEN
UND
LAGERUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMID
GELEN
........................................................
63
6.7.5.
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
................................................................................
63
II
6.7.6.
COOMASSIE
FAERBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMID
GELEN
..........................................................
63
6.7.7.
WESTERN
BLOT
..........................................................................................................................
64
6.7.8.
STRIPPEN
DER
NITROCELLULOSE-MEMBRAN
..................................................................................
64
6.7.9.
ANALYSE
VON
CD22
UBIQUITINILIERUNG
.....................................................................................
64
6.8.
PROTEOMICS
.....................................................................................................................................
65
6.8.1.
AFFINITAETSAUFREINIGUNG
UEBER
DEN
TWIN-STREP-TAG
FUER
MASSENSPEKTROMETRISCHE
ANALYSE
...
66
6.8.2.
PROBENVERARBEITUNG
BEI
IN-GEL
VERDAU
VERFAHREN
................................................................
67
6.8.3.
PROBENAUFBEREITUNG
BEI
ON-BEAD
VERDAU
UND
DIMETHYLLABELING
.........................................
68
6.8.4.
MASSENSPEKTROMETRISCHE
ANALYSE
UND
AUSWERTUNG
DER
DATEN
AM
BESIPIEL
DER
CD22-TST
EXPERIMENTE
.........................................................................................................................................
68
6.9.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
..................................................................................................
69
6.9.1.
OLIGONUKLEOTID
DESIGN
...........................................................................................................
69
6.9.2.
GEWINNUNG
VON
DNA
AUS
MURINEN
BIOPSIEN
.......................................................................
69
6.9.3.
GENOTYPISIERUNG
VON
MAEUSEN
MITTELS
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
......................
69
6.9.4.
PCR
ZUM
ANFUEGEN
VON
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
UND
AUFREINIGUNGSTAGS
........................
74
6.9.5.
GELELEKTROPHORESE
..................................................................................................................
75
6.9.6.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
................................................................................
75
6.9.7.
SCHNELLVERFAHREN
ZUR
DNA
ISOLATION
(MINIPRAEPARATION)
........................................................
75
6.9.8.
DNA
ISOLATION
(MINIPRAEPARATION)
............................................................................................
76
6.9.9.
RESTRIKTIONSVERDAU
.................................................................................................................
76
6.9.10.
GELEXTRAKTION
VON
DNA
FRAGMENTEN
..................................................................................
76
6.9.11. LIGATION
ALLGEMEIN
................................................................................................................
76
6.9.12. LIGATION
VON
PCR
FRAGMENTEN
IN
PJET
1
,2/BLUNT
VEKTOR
....................................................
77
6.9.13.
STERILFAELLUNG
VON
DNA
..........................................................................................................
77
6.9.14.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
....................................................................................................
77
6.9.15.
RNA
ISOLATION
.......................................................................................................................
77
6.9.16.
CDNA
SYNTHESE
....................................................................................................................
78
6.9.17.
REAL-TIME-QUANTITATIVE-PCR
...............................................................................................
78
6.9.18.
NEXT
GENERATION
SEQUENCING
...............................................................................................
79
6.9.18.1.
VORBEREITEN
DER
PROBEN
..............................................................................................
79
6.9.16.2.
NEXT
GENERATION
SEQUENCING
MIT
DEM
HLUMINA-MISEQ
SYSTEM
................................
81
6.9.18.3.
NEXT
GENERATION
SEQUENCING
AUSWERTUNG
.................................................................
82
6.10.
GRUNDSERUM
ELISA
.....................................................................................................................
83
7.
ERGEBNISSE
.............................................................................................................
85
7.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
CD22
INTERAKTOMS
......................................................................................
85
7.1.1.
ETABLIERUNG
DER
AFFINITAETSAUFREINIGUNG
FUER
CD22-TST-DT40
ZELLEN
...................................
85
7.1.2.
BESTIMMUNG
DER
KULTIVIERUNGSZEIT
VON
DT40
ZELLEN
FUER
SILAC
MARKIERUNG
......................
87
7.1.3.
CD22
INTERAKTOM-ANALYSE
IN
DT40
ZELLEN
..........................................................................
87
7.1.4.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
NEUER
CD22
INTERAKTIONSPARTNER
.......................................................
88
7.1.4.1.
SERCA2
..........................................................................................................................
88
7.1.4.1.1.
VERIFIKATION
DER
CD22-SERCA2
INTERAKTION
...........................................................
88
III
7.1.4.1.2.
VERSTAERKTE
CALCIUM
FREISETZUNG
AUS
DEM
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUM
IN
CD22
DEFIZIENTEN
B-ZELLEN
NACH
SERCA2
INHIBITION
................................................................
89
7.1.4.2.
RHOH
................................................................................................................................
91
7.1.4.2.1.
VERIFIKATION
DER
CD22-RHOH
INTERAKTION
................................................................
91
7.1.4.2.2.
VERRINGERTE
RHOH
MRNA
EXPRESSION
IN
CD22
A
B-ZELLEN
......................................
91
7.1.4.2.3.
KEINE
REGULATION
DER
LFA-1
EXPRESSION
AUF
DER
OBERFLAECHE
VON
CD22
V
B-ZELLEN
DURCH
RHOH
EXPRESSION
..............................................................................................................
92
7.1.4.3.
BCAP
...............................................................................................................................
93
7.1.4.3.1.
VERIFIKATION
DER
CD22-BCAP
INTERAKTION
..............................................................
93
7.1.4.3.2.
DER
EINFLUSS
VON
0022
AUF
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
DES
AKT
SIGNALWEGS
............
94
7.1.4.4.
CULLIN3
..............................................................................................................................
95
7.1.4.4.1.
VERIFIKATION
DER
CD22-CULLIN3
INTERAKTION
..............................................................
95
7.1.4.4.2.
VERRINGERTE
0022
UBIQUITINILIERUNG
NACH
BZR
STIMULATION
DURCH
CULLIN3
INHIBITION
.......................................................................................................................................
96
7.1.4.4.3.
BEEINTRAECHTIGUNG
DER
0022
INTERNALISIERUNG
NACH
BZR
STIMULATION
DURCH
CULLIN
INHIBITOR
BEHANDLUNG
..................................................................................................................
98
7.1.4.4.4.
KEIN
EINFLUSS
VON
CULLIN3
AUF
ANTI-0022
ANTIKOERPER
VERMITTELTE
0022
ENDOZYTOSE
................................................................................................................................
101
7.1.4.4.5.
VERRINGERTE
B-ZELL
POUPLATIONEN
IN
B-ZELL
SPEZIFISCHE
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
MAEUSEN
.......................................................................................................................................
102
7.1.4.4.6.
APOPTOTISCHER
PHAENOTYP
IN
01113*
MB1
CRE/+
B-ZELLEN
.......................................
108
7.1.4.4
7.
0022
UEBEREXPRESSION
AUF
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
B-ZELLEN
........................................
110
7.1.4.4.8.
KEINE
DURCHGAENGIGE
UEBEREXPRESSION
VON
OBERFLAECHEN
PROTEINEN
AUF
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
B-ZELLEN
.......................................................................................................................
111
7.1.4.4.9.
KEINE
0022
INTERNALISIERUNG
NACH
BZR
STIMULATION
IN
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
B-
ZELLEN
...........................................................................................................................................
112
7.1.4.4.10.
VORAKTIVIERTER
PHAENOTYP
VON
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
B-ZELLEN
...................................
113
7.1.4.4.11.
VERRINGERTE
IMMUNGLOBULIN
LEVEL
IM
SERUM
NAIVE
JUNGER
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
MAEUSE
..........................................................................................................................................
114
7.1.4.4.12.
VERAENDERTE
CALCIUM
MOBILISIERUNG
UNREIFER
CUL3
FL/FL
MB1
CRE/+
B-ZELLEN
IM
KNOCHENMARK
.............................................................................................................................
115
7.1.4.4.13.
KEIN
CULLIN3
DOSIS
ABHAENGIGER
EFFEKT
IN
B-ZELLEN,
SOWIE
KEIN
EINFLUSS
DER
CRE
REKOMBINASE
IN
CULS^^MBL
0
^
MAEUSEN
FESTSTELLBAR
......................................................
116
7.1.4.5.
KLHL6
............................................................................................................................
118
7.1.4.5.1.
NORMALE
0022
EXPRESSIONSLEVEL
IN
KLHL6
DEFIZIENTE
B-ZELLEN
........................
118
7.2.
CHARAKTERISIERUNG
DES
SIGLEC-G
INTERAKTOMS
............................................................................
119
7.3.
EINFLUSS
VON
0022
UND
SIGLEC-G
AUF
DIE
KEIMZENTRUMSREAKTION
............................................
121
7.3.1.
ANALYSE
DER
KEIMZENTRUMSREAKTION
IN
CD22
*
/
*
-
UND
0022
A
X
SIGLEC-G
Z
-MAEUSEN
NACH
IMMUNISIERUNG
MIT
SCHAFSERYTHROZYTEN
...........................................................................................
121
7.3.1.1.
TEILWEISE
UNTERSCHIEDE
IN
DER
KEIMZENTRUMSREAKTION
VON
CD22
/
-
UND
CD22
/
X
SIGLEC-G
^-MAEUSEN
........................................................................................................................
121
IV
7.3.1.2.
VERSTAERKTE
CALCIUM-MOBILISIERUNG
NACH
B-ZELL-REZEPTOR-STIMULATION
IN
CD22
-/
UND
CD22
Z
*
X
SIGLEC-G
*
7
KEIMZENTRUMS-B-ZELLEN
..............................................................................
124
7.3.2.
ANALYSE
DER
ROLLE
VON
CD22
IN
DER
KEIMZENTRUMSREAKTION
MITTELS
KNOCHENMARKSCHIMAERE
.....................................................................................................................
126
7.3.2.1. NACHTEIL
CD22
/_
NAIVER
B-ZELLEN
IN
DER
PERIPHERIE
IN
EINEM
KOMPETITIVEN
SYSTEM
.126
7.3.2.2.
BENACHTEILIGUNG
VON
CD22
V
KEIMZENTRUMS-B-ZELLEN
IN
DER
KEIMZENTRUMSREAKTION,
ABER
KEINEN
DEFEKT
IM
IMMUNGLOBULIN-
KLASSENWECHSEL
............................................................
128
7.3.2.3.
ERHOEHTE
CALCIUM-MOBILISERUNG
IN
CD22
7
KEIMZENTRUMS-B-ZELLEN
IM
KOMPETITIVEN
SYSTEM
............................................................................................................................................
131
7.3.2.4.
ANALYSE
DER
AFFINITAETSREIFUNG
VON
CD22
/
*
KEIMZENTRUMS-B-ZELLEN
IM
KOMPETITIVEN
SYSTEM
............................................................................................................................................
132
8.
DISKUSSION
............................................................................................................
133
8.1.
ANALYSE
DES
CD22
INTERAKTOMS
.................................................................................................
133
8.1.1.
DIE
ROLLE
VON
SERCA2
IN
CD22
DEFIZIENTEN
B-ZELLEN
......................................................
135
8.1.2.
KEIN
EINFLUSS
DER
TRANSKRIPTIONELLEN
REGULATION
VON
RHOH
AUF
DIE
ZELLADHAESION
VIA
LFA-1
IN
CD22
DEFIZIENTEN
B-ZELLEN
...........................................................................................................
136
8.1.3. KEINE
BEEINFLUSSUNG
DES
PI3K
SIGNALWEGS
DURCH
DIE
INTERAKTION
VON
CD22
UND
BCAP
NACH
BZR
STIMULATION
.......................................................................................................................
138
8.1.4.
DIE
ROLLE
VON
CULLIN3
IN
B-ZELLEN
MIT
BEZUG
AUF
CD22
.....................................................
139
8.1.4.1. DER
EINFLUSS
VON
CULLINS
AUF
DIE
DURCH
BZR
STIMULATION
INDUZIERTE
CD22
INTERNALISIERUNG
...............................................................................................................................
139
8.1.4.2. DER
EINFLUSS
VON
CULLIN3
AUF
B-ZELL
ENTWICKLUNG
UND
B-ZELL
AKTIVIERUNG
...................
145
8.1.4.3. DER
EINFLUSS
VON
CULLIN3
AUF
EXPRESSION
VON
CD22
UND
WEITEREN
OBERFLAECHEN
REZEPTOREN
.....................................................................................................................................
147
8.2.
ANALYSE
DES
SIGLEC-G
INTERAKTOMS
..............................................................................................
150
8.3.
DIE
ROLLE
VON
CD22
UND
SIGLEC-G
IN
DER
KEIMZENTRUMSREAKTION
..............................................
151
9.
LITERATURVERZEICHNIS
.............................................................................................
158
10.
ANHANG
...............................................................................................................
179
10.1.
ABBILDUNGS-
UND
TABELLENVERZEICHNIS
.....................................................................................
179
10.2.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.............................................................................................................
182
10.3.
CD22
INTERAKTOM
ANALYSEN
IN
UNSTIMULIERTEN
CD22-TST-DT40
ZELLEN
...................................
186
10.4.
CD22
INTERAKTOM
ANALYSEN
IN
STIMULIERTEN
CD22-TST-DT40
ZELLEN
.......................................
187
10.5.
CD22
INTERAKTOM
ANALYSEN
DIREKTER
VERGLEICH
UNSTIMULIERTER
GEGENUEBER
STIMULIERTEN
CD22-
TST-DT40
ZELLEN
....................................................................................................................................
188
10.6.
SIGLEC-G
INTERAKTOME
DATENSATZ
..............................................................................................
189
11.
DANKSAGUNG
......................................................................................................
190
12.
PUBLIKATIONSLISTE
.................................................................................................
192
V
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