Ein revers-genetisches System für nicht kultivierbare feline Coronaviren als Grundlage für das Studium der felinen infektiösen Peritonitis:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Giessen
VVB Laufersweiler Verlag
2018
|
| Ausgabe: | 1. Auflage |
| Schriftenreihe: | Edition scientifique
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | X, 142 Seiten Illustrationen, Diagramme |
| ISBN: | 9783835967250 |
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INHALTSVERZEICHNIS.............................................................................................................................I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................................
VI
TABELLENVERZEICHNIS.....................................................................................................................
VII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS..............................................................................................................
VIII
1
EINLEITUNG.......................................................................................................................................1
1.1
CORONAVIREN............................................................................................................................
1
1.1.1
TAXONOMIE.......................................................................................................................
1
1.1.2
MORPHOLOGIE....................................................................................................................5
1.1.3
GENOMORGANISATION.........................................................................................................
6
1.1.4 REPLIKATION VON
CORONAVIREN.........................................................................................
8
1.2 FELINE
CORONAVIREN................................................................................................................14
1.2.1
SEROTYPEN.......................................................................................................................
14
1.2.2
BIOTYPEN.........................................................................................................................
15
1.2.3 DIE MOLEKULARE PATHOGENESE DER
FIP...........................................................................
16
1.2.4 REVERSE GENETIK BEI FELINEN CORONAVIREN
...................................................................
20
1.2.5 ZIELSETZUNG DIESER
ARBEIT.............................................................................................
22
2
MATERIAL.............................................................................................................................
23
2.1
ZELLEN....................................................................................................................................
23
2.1.1 EUKARYOTISCHE
ZELLEN....................................................................................................23
2.1.2 PROKARYOTISCHE
ZELLEN...................................................................................................23
2.2
VIREN.....................................................................................................................................
23
2.3
PLASMIDE...............................................................................................................................
23
2.4
ENZYME.................................................................................................................................
24
2.5
CHEMIKALIEN.........................................................................................................................24
2.6
ANTIKOERPER............................................................................................................................26
2.6.1
PRIMAERANTIKOERPER...........................................................................................................26
2.6.2
SEKUNDAERANTIKOERPER.......................................................................................................26
2.7 K
ITS.......................................................................................................................................
27
2.8
NAEHRMEDIEN..........................................................................................................................27
2.8.1
BAKTERIENKULTURMEDIEN................................................................................................
27
2.8.2
ZELLKULTURMEDIEN..........................................................................................................28
2.8.3
ZELLKULTURZUSAETZE..........................................................................................................28
2.8.4 ZUSAMMENSETZUNG DER MEDIEN FUER DIE EINZELNEN ZELLLINIEN
....................................
28
2.9 LOESUNGEN UND
PUFFER...........................................................................................................
29
2.9.1 ALLGEMEINE LOESUNGEN UND
PUFFER................................................................................
29
2.9.2 LOESUNGEN UND PUFFER FUER
AGAROSEGELE.........................................................................29
2.9.3 LOESUNGEN UND PUFFER FUER SDS-PAGE UND WESTERN B LO
T......................................... 29
2.9.4 LOESUNGEN UND PUFFER FUER DAS REVERS-GENETISCHE SYSTEM
...........................................
30
2.9.5 PUFFER UND MEDIEN ZUR HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN
.....................................
30
2.10
GROESSENMARKER.....................................................................................................................
31
2.11
VERBRAUCHSMATERIALIEN......................................................................................................
31
2.12 G
ERAETE..................................................................................................................................32
2.13
VERSUCHSTIERE......................................................................................................................
33
2.14 SYNTHETISCHE
DNA-OLIGONUKLEOTIDE................................................................................
33
2.14.1 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE AMPLIFIZIERUNG DES FECV-GENOMS
.................................
34
2.14.2 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE AMPLIFIZIERUNG VON REKOMBINATIONSSTELLEN
ZUR
KLONIERUNG DER SELEKTIONSPLASMIDE
......................................................................................
35
2.14.3 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE KONTROLLE DER SELEKTIONEN
.................................................
36
2.14.4 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE VOLLSTAENDIGKEITSKONTROLLE UND
SEQUENZIERUNG DER
REKOMBINANTEN VACCINIAVIREN VRECFECV-S
7 9
.....................................................................
37
2.14.5 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE VOLLSTAENDIGKEITSKONTROLLE UND
SEQUENZIERUNG DER
REKOMBINANTEN VACCINIAVIREN
VRECFECV.............................................................................
38
2.14.6 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE KLONIERUNG VON
PTREPURFECV-N...................................39
2.14.7 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE
QRT-PCR.............................................................................39
3 M
ETHODEN.................................................................................................................................
40
3.1 ARBEITEN MIT Z
ELLEN.............................................................................................................
40
3.1.1 ALLGEMEINE
TECHNIKEN..................................................................................................40
3.1.2 BESTIMMUNG DER
ZELLZAHL..............................................................................................40
3.1.3 KRYOKONSERVIERUNG VON
ZELLEN....................................................................................
41
3.1.4 INFEKTION VON
ZELLEN.....................................................................................................
41
3.1.5 TRANSFEKTION VON NUKLEINSAEUREN IN SAEUGERZELLEN
......................................................
41
3.1.5.1 CHEMISCHE
TRANSFEKTION.......................................................................................
41
3.1.5.2 PHYSIKALISCHE TRANSFEKTION (ELEKTROPORATION)
....................................................
42
3.1.6 HERSTELLUNG EINER ZELLLINIE, DIE DAS FECV-N-PROTEIN EXPRIMIERT
.............................
42
3.2 ARBEITEN MIT
BAKTERIEN........................................................................................................
43
3.2.1 ANZUCHT VON
BAKTERIEN.................................................................................................43
3.2.2 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN
.................................................
43
3.2.3
TRANSFORMATION.............................................................................................................
44
3.3 ARBEITEN MIT
DNA...............................................................................................................
44
3.3.1
DNA-ISOLIERUNG............................................................................................................
44
3.3.1.1 PLASMID-DNA-PRAEPARATION AUS PROKARYOTISCHEN
ZELLEN......................................44
3.3.1.1.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN
MASSSTAB..........................44
3.3.1.1.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN
MASSSTAB..........................44
3.3.1.2 DNA-ISOLIERUNG AUS EUKARYOTISCHEN
ZELLEN.........................................................45
3.3.1.2.1 PRAEPARATION VON VACCINIAVIRUS-DNA IM ANALYTISCHEN M ASSSTAB
...............
45
3.3.1.2.2 PRAEPARATION VON VACCINIAVIRUS-DNA IM PRAEPARATIVEN M ASSSTAB
...............
45
3.3.2 REINIGUNG VON
DNA.....................................................................................................46
3.3.2.1 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION MIT ETHANOLPRAEZIPITATION
..................................
46
3.3.2.2 REINIGUNG VON
PCR-PRODUKTEN.............................................................................46
3.3.2.3
GELEXTRAKTION..........................................................................................................
46
3.3.3
DNA-ANALYSE...............................................................................................................
46
3.3.3.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE.....................................................................................
46
3 3 3 .2
SANGER-SEQUENZIERUNG.......................................................................................47
3.3.3.3 NEXT GENERATION
SEQUENCING..................................................................................47
3.3.4
PCR-TECHNIKEN............................................................................................................
47
3.3.4.1 AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PC R
)..................................................................................................................................
47
3.3.4.2
MUTAGENESE-PCR...................................................................................................48
3.3.5 METHODEN ZUR KLONIERUNG VON DNA
..........................................................................
49
3.3.5.1
KLONIERUNG.............................................................................................................
49
3.3.5.2
RESTRIKTIONSVERDAU.................................................................................................50
3.3.5.3 DEPHOSPHORYLIERUNG
..............................................................................................
50
3.3.5.4
LIGATION..................................................................................................................
50
3.3.5.5 KONSTRUKTION VON
PLASMIDEN.................................................................................50
3.3.5.5.1 SELEKTIONSPLASMIDE ZUR HERSTELLUNG REKOMBINANTER VACCINIAVIREN
...........
50
3.3.5.5.2 KONSTRUKTION VON
PTREPURFECV-N............................................................52
3.4 ARBEITEN MIT R N A
...............................................................................................................
52
3.4.1 RNA-ISOLIERUNG AUS KOTPROBEN, KULTURUEBERSTAENDEN UND
PARTIKELSUSPENSIONEN
....
52
3.4.2 RNA-ISOLIERUNG AUS
ZELLEN..........................................................................................
53
3.4.3 REVERSE TRANSKRIPTION ZUR SYNTHESE VON CDNA
......................................................
53
3.4.4 QUANTITATIVE RT-PCR (QRT-PCR)
..............................................................................
53
3.4.5 IN-VITRO-TRANSKRIPTION
(IVT)........................................................................................
55
3.4.6 RNA-ANALYSE MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE
......................................................
56
3.5 ARBEITEN MIT V
IREN...............................................................................................................56
3.5.1 FELINE
CORONAVIREN.......................................................................................................
56
3.5.1.1
TITERBESTIMMUNG....................................................................................................
56
3.5.1.2
WACHSTUMSKURVEN..................................................................................................
57
3.5.1.3 REINIGUNG UND KONZENTRATION VON REKOMBINANTEN FECV-PARTIKELN
MITTELS
ULTRAZENTRIFUGATION..............................................................................................................57
3.5.1.4 DARSTELLUNG REKOMBINANTER FCOVS MIT ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.......................
58
3.5.1.5 CAPSID PROTECTION A SSAY
.......................................................................................
58
3.5.2
VACCINIAVIRUS.................................................................................................................
59
3.5.2.1 GENERIERUNG REKOMBINANTER
VACCINIAVIREN..........................................................59
3.5.2.2 SELEKTION REKOMBINANTER
VACCINIAVIREN...............................................................
59
3.5.2.2.1
POSITIVSELEKTION...............................................................................................59
3.5.2.2.2
NEGATIVSELEKTION..............................................................................................60
3.5.2.3 PLAQUEREINIGUNG REKOMBINANTER VACCINIAVIREN
...................................................
60
3.6 HERSTELLUNG REKOMBINANTER
VIREN.......................................................................................
61
3.6.1 HERSTELLUNG REKOMBINANTER VACCINIAVIREN (VRECFECV-S
79
UND VRECFECV)
...........
61
3.6.2 HERSTELLUNG REKOMBINANTER
FCOVS..............................................................................62
3.7 ARBEITEN MIT
PROTEINEN.......................................................................................
63
3.7.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
................................................
63
3.7.2 SEMI-DRY PROTEINTRANSFER VON SDS-GELEN AUF NITROCELLULOSEMEMBRANEN
..............
64
3.7.3 WESTERN B
LOT..................................................................................................................64
3.8 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON K
ATZEN................................................................................
65
3.8.2 AUSWERTUNG DER GESAMMELTEN
PROBEN.....................................................................66
3.9 BIOINFORMATISCHE AUSWERTUNG VON
DATEN..........................................................................66
4
ERGEBNISSE................................................................................................................................
67
4.1 BESTIMMUNG DER GESAMTGENOMSEQUENZ EINES SEROTYP I
FECV-FELDISOLATS..................67
4.2 HERSTELLUNG REKOMBINANTER VACCINIAVIREN MIT
FCOV-CDNAS......................................... 68
4.2.1 HERSTELLUNG DES REKOMBINANTEN VACCINIAVIRUS VRECFECV-S
79
..................................69
4.2.1.1 HERSTELLUNG VON VRECFCOV-II-FECV-3A-3
UTR
.......................................................70
4.2.1.2 HERSTELLUNG VON VRECFECV_IB
-3
UTR-S
79
............................................................... 72
4.2.1.3 HERSTELLUNG VON VRECFECV-S
79
.............................................................................74
4.3 HERSTELLUNG (,JLESCUE*) VON REKOMBINANTEM FELINEM CORONAVIRUS
RECFECV-S
7 9
.........76
4.3.1 HERSTELLUNG VON RECFECV-S
79
-R N A
...........................................................................76
4.3.2 HERSTELLUNG EINER BHK-ZELLLINIE, DIE DAS N-PROTEIN VOM
FECV-FELDISOLAT
EXPRIMIERT................................................................................................................................
77
4.3.3 HERSTELLUNG (*RESCUE*) UND CHARAKTERISIERUNG VON REKOMBINANTEM
FELINEM
CORONAVIRUS
RECFECV-S79.....................................................................................................78
4.4 HERSTELLUNG DES REKOMBINANTEN VACCINIAVIRUS VRECFECV
..............................................
80
4.5 HERSTELLUNG, NACHWEIS UND CHARAKTERISIERUNG VON REKOMBINANTEM FEC V
(RECFEC V) 84
4.6 ETABLIERUNG VON NACHWEISVERFAHREN FUER
RECFECV...........................................................85
4.6.1
ELEKTRONENMIKROSKOPIE.................................................................................................85
4.6.2 WESTERN B
LOT.................................................................................................................
86
4.6.3 CAPSID PROTECTION ASSAY
..............................................................................................
87
4.7 QUANTIFIZIERUNG VON VIRUSSTOCKS VON
RECFECV................................................................
89
4.8 INFEKTION VON KATZEN MIT RECFECV UND RECFECV-S
7 9
....................................................
90
4.8.1 DURCHFUEHRUNG UND AUSWERTUNG DES TIERVERSUCHS
.....................................................
90
4.8.2 POSTMORTALE ANALYSE VON KATZE
1................................................................................92
5
DISKUSSION...................................................................................................................................
95
5.1 ETABLIERUNG EINES REVERS-GENETISCHEN SYSTEMS FUER EIN SEROTYP I
FECV-FELDVIRUS
.......
96
5.2 CHARAKTERISIERUNG VON RECFECV
IN VIVO
............................................................................97
5.3 REZEPTORSPEZIFITAET FELINER
CORONAVIREN..............................................................................99
5.4 ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN FUER DAS REVERS-GENETISCHE SYSTEM BASIEREND
AUF SEROTYP I
FCOV-FELDVIRUS........................................................................................................................
101
5.4.1 ANSAETZE ZUR ERFORSCHUNG DER MOLEKULAREN PATHOGENESE DER F1P MIT
REKOMBINANTEN
SEROTYP 1
FELDVIREN...............................................................................................................101
5.4.2 CHARAKTERISIERUNG DER AKZESSORISCHEN PROTEINE MITHILFE VON
RECFCOVS
................
102
5.4.3 REVERSE GENETIK ZUR HERSTELLUNG REKOMBINANTER SEROTYP I FCOVS ALS
POTENZIELLE
VAKZINEKANDIDATEN...............................................................................................................104
5.4.4 REVERS-GENETISCHE SYSTEME ZUR CHARAKTERISIERUNG NICHT
KULTIVIERBARER CORONAVIREN
106
6
ZUSAMMENFASSUNG.....................................................................................................................108
7
SUMMARY....................................................................................................................................110
8
LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................................................112
9
DANKSAGUNG...............................................................................................................................
139
10
LEBENSLAUF...............................................................................................................................
142
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| discipline | Agrar-/Forst-/Ernährungs-/Haushaltswissenschaft / Gartenbau |
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