Verfügbarkeit: Charakterisierung neuer Komponenten des Wnt-Signalwegs, Pgam5

Charakterisierung neuer Komponenten des Wnt-Signalwegs, Pgam5:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Heller, Jens (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Erlangen ; Nürnberg 2018
Schlagworte:	Signaltransduktion Wnt-Proteine Glatter Krallenfrosch Catenine Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS.........................................................................................................................................................................IV ABKUE RZU NGSVERZEICHNIS.............................................................................................................................................................VIII ABBILDUNGSVERZEICHNIS.................................................................................................................................................................XI TABELLENVERZEICHNIS...................................................................................................................................................................XIII ZUSAMMENFASSUNG.....................................................................................................................................................................XIV ABSTRACT......................................................................................................................................................................................... XV EINLEITUNG.........................................................................................................................................................................................1 XENOPUS LAEVIS - EIN MODELLLORGANISMUS..................................................................................................................1 DER BMP-SIGNALWEG................................................................................................................................................... 4 DIE WNT-SIGNALWEGE.................................................................................................................................................. 6 DER KANONISCHE WNT-SIGNALWEG........................................................................................................................... 8 DISHEVELLED UND SS-ARRESTIN - SCHLUESSELPROTEINE DES WNT/SS-CATENIN -SIGNALWEGS ......................................... 10 PGAM5.......................................................................................................................................................................24 ZIEL DER ARB EIT........................................................................................................................................................... 18 M ATERIAL UND M ETH ODEN............................................................................................................................................................ 19 M ATERIAL.....................................................................................................................................................................19 VERSUCHSTIERE UND ORGANISMEN...........................................................................................................................19 VERWENDETE PROGRAMME UND PLUG-INS.............................................................................................................. 20 PUFFER UND LOESUNGEN...........................................................................................................................................21 NAEHRMEDIEN FUER BAKTERIENZELLEN UND ZUSAETZE...................................................................................................23 MEDIEN UND REAGENZIEN FUER DIE ZELLKULTUR........................................................................................................23 MORPHOLINOS.........................................................................................................................................................24 OLIGONUKLEOTIDE................................................................................................................................................... 25 DNA-KONSTRUKTE..................................................................................................................................................26 KITS........................................................................................................................................................................27 ENZYME................................................................................................................................................................. 28 ANTIKOERPER............................................................................................................................................................29 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN............................................................................................................................. 30 VERBRAUCHSMATERIALIEN....................................................................................................................................... 33 GERAETELISTE............................................................................................................................................................35 IV METHODEN.................................................................................................................................................................. 37 TIEREXPERIMENTELLE M ETHODEN............................................................................................................................ 37 TESTIS-PRAEPARATION............................................................................................................................................37 GEWINNUNG VON XENOPUS EIERN UND IN VITRO BEFRUCHTUNG ............................................................................ 37 MIKROINJEKTION.................................................................................................................................................. 38 DOPPELACHSENASSAY (MCCREA ET AL., 1993)......................................... 38 HISTOLOGISCHE M ETHODEN...................................................................................................................................... 39 PRAEPARATION VON ANIMALEN KAPPEN................................................................................................................ 39 FIXIERUNG VON EMBRYONEN IN FORMALDEHYDLOESUNG................................................................................... 39 LN-SITU HYBRIDISIERUNG (HARLAND, 1991)...........................................................................................................39 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN........................................................................................................................41 RNA SYNTHESE...................................................................................................................................................41 CDNA-SYNTHESE.................................................................................................................................................42 KLONIERUNG -PCR................................................................................................................................................42 KLONIERUNG - RESTRIKTIONSVERDAU.................................................................................................................... 43 LIGIERUNG...........................................................................................................................................................44 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA C O LI..............................................................................................................44 MINI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA............................................................................................................... 44 MIDI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA............................................................................................................... 45 RNA EXTRAKTION.................................................................................................................................................45 VEKTOR-DEPHOSPHORYLIERUNG...........................................................................................................................45 GELELEKTROPHORESE........................................................................................................................................... 45 ZELLKULTUR-BASIERTE METHODEN............................................................................................................................. 46 KULTIVIERUNG VON HEK 293-T ZELLEN................................................................................................................. 46 KULTIVIERUNG VON XTC-ZELLEN............................................................................................................................46 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL................................................................................................................................ 46 AUSSAAT VON ZELLKULTUREN IN PLASTIK-WELL-GEFAESSEN........................................................................................ 46 TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT LIPOFECTAMIN..................................................................................................... 46 TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT POLYETHYLENIMIN................................................................................................47 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.........................................................................................................................48 IMMUNOHISTOCHEMIE HEK 293-T ZELLEN......................................................................................................... 48 MITOTRACKER (MITOTRACKER RED CMXROS CAT NO. M7512)........................................................................... 48 NANOBIT ASSAY..................................................................................................................................................48 STATISTISCHE AUSWERTUNG......................................................................................................................................50 MANDERS COEFFIZIENT........................................................................................................................................ 50 ERGEBNISSE...................................................................................................................................................................................... 51 PGAM5 DEFIZIENTE XENOPUS LAEVIS EMBRYONEN ZEIGEN EINEN VERGLEICHBAREN PHAENOTYPEN WIE NACH DKKL KNOCK- DOW N..........................................................................................................................................................................51 V PGAMS INHIBIERT WNT-INDUZIERTE ACHSENDUPLIKATION IN XENOPUS IAEVIS...............................................................55 DIE MITOCHONDRIALE LOKALISATION VON XENOPUS PGAM5 WIRD DURCH DAS N-TERMINALE SIGNALPEPTID VERMITTELT.... 59 LOKALISATION VON PGAM5 IN ABHAENGIGKEIT DES WNT/6-CATENIN-SIGNALWEGS ......................................................... 61 EKTOPISCHES PGAMS ZEIGT DIE GLEICHE SUBZELLULAERE LOKALISATION WIE ENDOGENES PGAMS ............................... 61 AKTIVIERUNG DES WNT/SS-CATENIN-SIGNALWEGS BEEINFLUSST NICHT DIE MITOCHONDRIALE LOKALISATION VON PGAMS 63 PGAMS CO-LOKALISIERT NICHT MIT LRP6...................................................................................................................64 PGAMS UND DISHEVELLED 2 ZEIGEN KEINE CO-LOKALISATION .................................................................................. 66 DISHEVELLED 3 COLOKALISIERT MIT PGAMS UNTER STIMULATION DES WNT/SS-CATENIN-SIGNALWEGS .......................... 67 STATISTISCHE CO-LOKALISATIONSAUSWERTUNG................................................................................................................68 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER CO-LOKALISATION VON PGAM5 M IT KOMPONENTEN DES WNT/SS-CATENIN-SIGNALWEGS ................................................................................................................................................................................... 74 DAS NANOBIT ASSAYZUR BESTIMMUNG VON PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN ZWISCHEN PGAM5 UND PROTEINEN DES WNT/SS-CATENIN-SIGNALWEGS..................................................................................................................................... 81 QUANTITATIVE AUSWERTUNG VON IN-SITU HYBRIDISIERUNGEN M IT HILFE VON IMAGE1 ..................................................... 85 DISKUSSION.................................................................................................................................................................................... ... QUANTITATIVER NACHWEIS VON PROTEIN-PROTEIN WECHSELWIRKUNGEN.........................................................................92 INTERAKTIONSBESTIMMUNG MIT HILFE VON NANOBIT ..........................................................................................97 MATHEMATISCHE QUANTIFIZIERUNG VON IN-SITU ERGEBNISSEN................................................................................ 99 PGAM5 BEEINFLUSST DIE ENTWICKLUNG DER ANTERIOR-POSTERIOREN ACHSE .................................................................. 101 PGAM5 IST IN VITRO IN DER LAGE DEN WNT/SS-CATENIN-SIGNALWEG ZU INHIBIEREN ..................................................... 103 DIE INHIBITORISCHE FUNKTION VON PGAM5 IST IN XENOPUS IAEVIS NICHT ABHAENGIG VON SEINER MITOCHONDRIALEN LOKALISATION............................................................................................................................................................ 104 PGAM5 BILDET MITOCHONDRIUM-UNABHAENGIG ANSAMMLUNGEN IM CYTOPLASMA .................................................... 106 PGAMS CO-LOKALISATIONEN ZEIGEN EINE MOEGLICHE INTERAKTION M IT DVL ................................................................. 107 LITERATURVERZEICHNIS ...... . .......................................................................................................................................................... 120 DANKSAGUNG................................................................................................................................................................................ 135 PUBLIKATIONSLISTE........................................................................................................................................................................136 LEBENSLAUF...................................................................................................................................................................................137 ANHANG.............................................................................................................................................................................................A STERBLICHKEITSRATE PGAM5 DNA INJEKTION..................................................................................................................A PLASMIDKARTEN.............................................................................................................................................................. B PCS2+ XPGAM5-HA................................................................................................................................................... B PCS2+ XPGAMS DSP-HA......................................................................................................................................... B PSP64T_WNT8......................................................................................................................................................... C PCS2+ MGFP............................................................................................... C PBITLL-C TKLGBIT MCS........................................................................................................................................... D PB IT LL-N TKLGBIT MCS........................................................................................................................................... D PBIT21-C TKSMBIT MCS...........................................................................................................................................E PBIT21-N TKSMBIT MCS.......................................................................................................................................... E LGBIT-PRKAR2A........................................................................................................................................................F SMBIT-PRKACA........................................................................................................................................................F NANOBIT NEGATIVE C ONTROL.................................................................................................................................... G PBIT21-C TKSMBIT XPGAMS................................................................................................................................... G PB IT LL-N TKLGBIT DVL3........................................................................................................................................... H PBIT21-N TKSMBIT DVL3.........................................................................................................................................H PB IT LL-N TKLGBIT DVL2.............................................................................................................................................1 PB IT LL-N TKLGBIT XARRB2........................................................................................................................................ 1 PB IT LL-N TKLGBIT XZRANBL..................................................................................................................................... J CHI-QUADRAT-TEST PHAENOTYPEN....................................................................................................................................K CHI-QUADRAT-TEST DOPPELACHSENASSAY...................................................................................................................... A SAMMLUNG CO-LOKALISATIONSBERECHNUNG................................................................................................................... D T-TEST CO-LOKALISATIONSBERECHNUNG.........................................................................................................................BB
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