Verfügbarkeit: Untersuchung zur Aktivierung von Toll-like Rezeptoren in zellbasierten Assays

Untersuchung zur Aktivierung von Toll-like Rezeptoren in zellbasierten Assays:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Herold, Kristina 1989- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Jena [2018?]
Schlagworte:	Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................I ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................... IV ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................1 SUMMARY............................................................................................................3 1 EINLEITUNG..................................................................................................5 1.1 ANGEBORENES IMMUNSYSTEM...................................................................5 1.2 TOLL-LIKE REZEPTOREN................................................................................5 1.2.1 VORKOMMEN VON T L R S.............................................................................6 1.2.2 STRUKTURELLER AUFBAU DER TLRS................................................................. 7 1.2.3 SIGNALSYSTEM DER TLR S............................................................................8 1.2.4 COREZEPTOREN DER TLRS.......................................................................... 11 1.2.5 LIGANDEN DER TLRS ............... 11 1.2.6 ROLLE VON TLRS IN ERKRANKUNGEN..........................................................13 1.3 NUCLEAR FACTOR-KAPPAB..........................................................................14 1.3.1 AUFBAU UND STRUKTUR...............................................................................14 1.3.2 SIGNALSYSTEM VON NF- K B ....................................................................... 16 1.3.3 BEDEUTUNG VON NF- K B............................................................................17 1.4 ZELLULAERE ASSAYS..................................................................................... 17 1.5 TLRS IN ZELLULAEREN ASSAYS....................................................................19 2 ZIELE DER ARBEIT....................................................................................20 3 MATERIAL UND METHODEN.....................................................................22 3.1 ZELLLINIEN................................................................................................22 3.2 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG DER ZELLEN................................................22 3.3 DESIGN DER NF- K B KONSTRUKTE..............................................................23 3.3.1 LUCIFERASE-REPORTERKONSTRUKT ............................................................... 23 3.3.2 FLUORESZENZ-MARKIERTES P65-KONSTRUKT ............................................... 24 3.4 KLONIERUNGEN.........................................................................................24 3.4.1 KLONIERUNG DER NF- K B KONSTRUKTE........................................................25 3.4.2 KLONIERUNG DER TLRS IN EXPRESSIONSVEKTOREN .................................... 27 3.5 GENERIERUNG STABILER ZELLLINIEN............................................................27 3.5.1 LENTIVIRALE METHODE................................................................................ 27 3.5.2 REKOMBINATIONSBASIERTE METHODE ........................................................ 28 3.6 GEWINNUNG VON RNA UND UMSCHREIBUNG IN CDNA ............................ 29 3.7 VERIFIZIERUNG DER STABILEN ZELLLINIEN DURCH REAL-TIME PCR .................. 30 3.8 LUCIFERASEASSAY.................................................................................... 31 3.8.1 DURCHFUEHRUNG.......................................................................................... 32 3.8.2 AUSWERTUNG............................................................................................. 33 3.9 P65-T RANSLOKATIONSASSAY..................................................................... 34 3.9.1 DURCHFUEHRUNG.......................................................................................... 34 3.9.2 AUSWERTUNG............................................................................................. 35 3.10 REAKTIONSREAGENZIEN............................................................................ 37 3.10.1 TLR-LIGANDEN.........................................................................................37 3.10.2 HITZEINAKTIVIERTE BAKTERIEN ..................................................................... 39 3.10.3 PATIENTENPLASMA ........................................... 40 3.10.4 TLR5-LNHIBITOR.........................................................................................40 3.11 STATISTIK.................................................................................................. 41 4 ERGEBNISSE..............................................................................................42 4.1 NACHWEIS DER STABILEN EXPRESSION DER TLR-KOMPLEXE IN LUCIFERASE- REPORTERZELLEN UND P65-FLUORESZENZ-ZELLEN.......................................42 4.2 LUCIFERASEASSAY.................................................................................... 42 4.2.1 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR2/CD14-KOMPLEXES DURCH TLR2-LIGANDEN............................................................................43 4.2.2 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR2/CD14-KOMPLEXES DURCH HITZEINAKTIVIERTE BAKTERIEN .......................................................... 48 4.2.3 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR5 DURCH FLAGELLIN ............ 52 4.2.4 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR2/CD14-KOMPLEXES UND DES TLR5 DURCH S. TYPHIMURIUM ........................................................... 53 4.2.5 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR2/CD14-KOMPLEXES UND DES TLR5 DURCH VERSCHIEDENE SALMONELLA STAEM M E..........................55 4.2.6 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR5 NACH ZUGABE EINES TLR5-LNHIBITORS.......................................................................................56 4.2.7 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT VON TLR-KOMPLEXEN DURCH PLASMAPROBEN VON PATIENTEN MIT SEPSIS ............................................. 59 4.2.8 ZUSAMMENFASSUNG DER TLR-AKTIVIERBARKEIT IM LUCIFERASEASSAY .... 60 4.3 P65-T RANSLOKATIONSASSAY..................................................................... 61 4.3.1 REAKTION DER ZELLEN NACH DER ZUGABE DER WASSERKONTROLLE ............... 61 4.3.2 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR2/CD14-KOMPLEXES DURCH TLR2-LIGANDEN........................................................................... 63 4.3.3 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERBARKEIT DES TLR2/CD14-KOMPLEXES DURCH HITZEINAKTIVIERTE BAKTERIEN..........................................................66 4.3.4 ZUSAMMENFASSUNG DER TLR-AKTIVIERBARKEIT IM P65- T RANSLOKATIONSASSAY ............................................................................. 70 5 DISKUSSION...............................................................................................71 5.1 ENTWICKLUNG ZWEIER ZELLBASIERTER ASSAYTYPEN ZUR UNTERSUCHUNG DER TLR-AKTIVIERBARKEIT........................................................................71 5.1.1 TLR-AKTIVIERBARKEIT IM LUCIFERASEASSAY.............................................. 72 5.1.2 TLR-AKTIVIERBARKEIT IM P65-TRANSLOKATIONSASSAY ............................... 82 5.2 EVALUIERUNG DER ERARBEITETEN ZELLBASIERTEN ASSAYSYSTEME .............. 84 5.3 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON TLR-AKTIVITAETEN ............................ 88 5.4 ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN DER ZELLBASIERTEN ASSAYS ...................... 92 6 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK.................................................94 7 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................... IX 8 ANHANG.................................................................................................. XVIII 8.1 TABELLENVERZEICHNIS..........................................................................XVIII 8.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS.......................................................................XIX 8.3 MATERIALIEN...........................................................................................XXI 8.3.1 ARBEITSGERAETE ........................................................................................ XXI 8.3.2 PLASMIDE.............................................................................................. XXII 8.3.3 OLIGONUKLEOTIDE.................................................................................. XXIII 8.3.4 SOFTWARE........................................................................................XXIII 8.3.5 CHEMIKALIEN UND LOESUNGEN.............................................................. XXIV 8.3.6 VERBRAUCHSMATERIALIEN.......................................................................XXV 8.3.7 REZEPTE DER VERWENDETEN M EDIEN .................................................. XXVI 8.4 EHRENWOERTLICHE ERKLAERUNG .............................................................. XXVII 8.5 DANKSAGUNG...............................................................................XXVIII
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