Untersuchung eines CREM-defizienten Mausmodells zur Bedeutung des cAMP-abhängigen Transkriptionsfaktors CREM für ventrikuläre Arrythmien:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
Münster
2018
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS V
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VIII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 KRANKHEITSBILD, EPIDEMIOLOGIE UND THERAPIEPRINZIPIEN DER
MENSCHLICHEN 1
HERZINSUFFIZIENZ
1.2 HERZPHYSIOLOGIE UND AKTIONSPOTENTIALE IM NICHT PATHOLOGISCHEN
ZUSTAND 3
1.2.1 ANATOMIE UND REIZLEITUNGSBAHNEN DES HERZENS 3
1.2.2 MIKROANATOMIE VON HERZMUSKELZELLEN 5
1.2.3 RUHE-MEMBRANPOTENTIAL UND DAS AKTIONSPOTENTIAL IN 6
HERZMUSKELZELLEN
1.2.4 ELEKTROMECHANISCHE KOPPLUNG IN KARDIOMYOZYTEN 9
1.2.5 REGULATION DER HERZAKTIVITAET DURCH KINASEN UND
PROTEIN-PHOSPHATASEN 11
1.3 KARDIALES REMODELING UND PATHOPHYSIOLOGISCHE VERAENDERUNG 13
BEI HERZINSUFFIZIENZ UND CHRONISCHER SS-ADRENERGER STIMULATION
1.4 GENESE VON KAMMERARRHYTHMIEN UND PROARRHYTHMOGENEN SUBSTRATEN 15
1.5 TRANSKRIPTIONSFAKTOREN DER CREB/CREM/ATF-1 -FAMILIE 17
1.5.1 PHYSIOLOGISCHE ROLLE DER GENREGULATION DURCH CREB/CREM 19
UND ATF-1
1.5.2 DAS CREM-KNOCKOUT MAUSMODELL UND DESSEN KARDIALER PHAENOTYP 20
1.6 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 22
2. MATERIAL & METHODEN 24
2.1 VERWENDETE TIERLINIEN, TIERZUCHT UND TIERHALTUNG 24
2.1.1 HALTUNG UND ZUCHT DER VERSUCHSTIERE 24
2.1.2 DIE CREM-KO-MAUSLINIE 24
2.1.3 DIE EPAC-TG-MAUSLINIE 25
2.1.4 GENERIERUNG DER CREM-KO X EPAC-MAUSLINIE 25
2.2 VERWENDETE PRIMER 25
2.3 CHEMIKALIEN 26
2.4 SOFTWARE, STATISTISCHE AUSWERTUNG UND DATENDARSTELLUNG 27
2.4.1 STATISTISCHE AUSWERTUNG UND DATENDARSTELLUNG 27
2.5 IN VIVO BEHANDLUNGEN UND OBERFLAECHEN-ELEKTROKARDIOGRAMM 28
2.5.1 IMPLANTATION VON OSMOTISCHEN MINIPUMPEN 28
2.5.2 OBERFLAECHEN-ELEKTROKARDIOGRAMM 29
2.6 ISOLATION VENTRIKULAERER KARDIOMYOZYTEN, ORGANPRAEPARATION UND
HERSTELLUNG 32
VON PROBEN FUER MIKROSKOPIE UND PROTEINANALYSEN
2.6.1 ISOLATION VON ADULTEN VENTRIKULAEREN MAUS-KARDIOMYOZYTEN 32
2.6.2 GROESSENMESSUNG VON ISOLIERTEN VENTRIKULAEREN KARDIOMYOZYTEN 33
2.6.3 MESSUNG VON VENTRIKELGEWICHTEN 34
2.6.4 HERSTELLUNG VON VENTRIKELHOMOGENATEN 34
2.7 PATCH-CLAMP MESSUNGEN AN VENTRIKULAEREN KARDIOMYOZYTEN 34
2.7.1 PATCH-CLAMP-MESSPLATZ UND -GEBRAUCHSLOESUNGEN 36
2.7.2 MESSPROTOKOLL FUER AKTIONSPOTENTIALE UND PROARRHYTHMISCHE
EREIGNISSE 37
2.7.3 PROTOKOLL ZUR MESSUNG VON L-TYP CA2+-STROEMEN 39
2.8 MESSUNG INTRAZELLULAERER CALCIUM-TRANSIENTEN 40
X X
2.8.1 BELADUNG VON KARDIOMYOZYTEN MIT LNDO-1/AM 42
2.8.2 MESSUNG VON CALCIUM-TRANSIENTEN UND SPONTANEN 43
CALCIUM-FREISETZUNGEN
2.8.3 MESSUNG DES SR-CALCIUM-GEHALTS 44
2.8.4 MESSUNG DES DIASTOLISCHEN CALCIUM-LECKS 45
2.9 KONFOKALMIKROSKOPISCHE MESSUNGEN 47
2.9.1 KONFOKALMIKROSKOPISCHE MESSUNG DER CAMP-BILDUNG 47
2.9.2 KONFOKALMIKROSKOPISCHE BESTIMMUNG DER CALCIUM-SPARK-FREQUENZ 49
2.10 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 49
2.10.1 GENOTYPISIERUNG VON VERSUCHSTIEREN 49
2.10.1.1 AUFSCHLUSS VON DNA AUS GEWEBEPROBEN UND 50
PCR-GENOTYPISIERUNG
2.10.1.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ZUR GROESSENAUFTRENNUNG VON DNA 51
2.10.2 MRNA-EXPRESSIONSANALYSE 52
2.10.2.1 MRNA ISOLATION AUS VENTRIKULAEREN KARDIOMYOZYTEN 52
2.10.2.2 DNASE-VERDAU UND RNA-AUFREINIGUNG 53
2.10.2.3 RNA-KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG 53
2.10.2.4 CDNA-SYNTHESE 53
2.10.2.5 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 54
2.11 PROTEIN-EXPRESSIONSANALYSE 56
2.11.1 PROTEINEXTRAKTION 56
2.11.2 PROTEIN-KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN 56
2.11.3 EINDIMENSIONALE, DISKONTINUIERLICHE PROTEIN-GELELEKTROPHORESE 57
2.11.4 WESTERN-BLOT 58
2.12 BESTIMMUNG DER CAMP-KONZENTRATION IN ZELLLYSATEN 60
2.13 BESTIMMUNG DER PROTEIN-PHOSPHATASE-1 UND -2A-AKTIVITAET 61
2.13.1 HERSTELLUNG VON 32P-MARKIERTER PHOSPHORYLASE A 62
2.13.2 MESSUNG DER PROTEIN-PHOSPHATASE-1 UND -2A-AKTIVITAET 63
2.14 BESTIMMUNG DER PKA- UND CAMKII-AKTIVITAET 64
2.14.1 MESSUNG DER PKA-AKTIVITAET 65
2.14.2 MESSUNG DER CAMKII-AKTIVITAET 66
3. ERGEBNISSE 67
3.0 VORVERSUCHE ZU CHRONISCHER ISOPRENALIN-STIMULATION UND KONTROLLEN 67
3.1 UNTERSUCHUNG DER IN VITRO UND IN VIVO ARRHYTHMIENEIGUNG 69
3.1.1 UNTERSUCHUNG DER SPONTANEN ELEKTRISCHEN AKTIVITAET 70
VENTRIKULAERER KARDIOMYOZYTEN
3.1.1.1 SPONTANE ELEKTRISCHE AKTIVITAET UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 71
3.1.1.2 SPONTANE ELEKTRISCHE AKTIVITAET UNTER AKUTER
ISOPRENALIN-STIMULATION 73
3.1.2 UNTERSUCHUNG VON SPONTANEN CALCIUM-FREISETZUNGEN 75
3.1.2.1 SPONTANE CALCIUM-FREISETZUNGEN UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 76
3.1.2.2 SPONTANE CALCIUM-FREISETZUNGEN UNTER ISOPRENALIN-STIMULATION 78
3.1.3 UNTERSUCHUNG DER ARRHYTHMIEHAEUFIGKEIT IM EKG 80
3.1.3.1 EKG-ARRHYTHMIEN UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 81
3.1.3.2 EKG-ARRHYTHMIEN UNTER AKUTER ISOPRENALIN-STIMULATION 82
3.1.4 UEBERLEBENSRATE ISOPRENALIN-VORBEHANDELTER TIERE 84
3.2 UNTERSUCHUNGEN ZU ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN PARAMETERN UND 85
DER CALCIUM-DYNAMIK
3.2.1 AKTIONSPOTENTIALE ISOLIERTER VENTRIKULAERER KARDIOMYOZYTEN 85
3.2.1.1 AKTIONSPOTENTIALE UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 86
3.2.1.2 AKTIONSPOTENTIALE UNTER AKUTER ISOPRENALIN-STIMULATION 87
3.2.1.3 AKTIONSPOTENTIAL-VERAENDERUNG BEI AKUTER ISOPRENALIN-STIMULATION
89
3.2.1.4 UNTERSUCHUNG DES L-TYP CALCIUM-STROMS 90
3.2.2 UNTERSUCHUNG DER INTRAZELLULAEREN CALCIUM-DYNAMIK ISOLIERTER 91
VENTRIKULAERER KARDIOMYOZYTEN
3.2.2.1 CALCIUM-TRANSIENTEN UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 92
3.2.2 2 CALCIUM-TRANSIENTEN UNTER AKUTER ISOPRENALIN-STIMULATION 93
3.2.2 3 VERAENDERUNG VON CALCIUM-TRANSIENTEN BEI ISOPRENALIN-STIMULATION
95
3.2.3 UNTERSUCHUNG DES SR-CALCIUM-GEHALTS 96
3.2.4 EKG-PARAMETER UND HERZFREQUENZEN 97
3.3 GROESSEN VENTRIKULAERER KARDIOMYOZYTEN UND VENTRIKELGEWICHTE 99
3.4 UNTERSUCHUNG DER CAMP-BILDUNG UNTER PHARMAKOLOGISCHER STIMULATION
101
3.5 AMPLITUDEN VON SPONTANEN DEPOLARISATIONEN UND CA2+-WELLEN 103
3.6 UNTERSUCHUNG DER MRNA- UND PROTEINEXPRESSION 104
3.6.1 MRNA-EXPRESSION IN ISOLIERTEN KARDIOMYOZYTEN 104
3.6.2 WESTERN-BLOT UNTERSUCHUNG DER PROTEINEXPRESSION 107
3.7 PROTEIN-PHOSPHATASE- UND PROTEIN-KINASE-AKTIVITAET 110
3.8 PROTEIN-PHOSPHORYLIERUNG UND PROTEIN-PHOSPHATASE-EXPRESSION 112
3.9 DIASTOLISCHES CALCIUM-LECK UND CALCIUM-SPARKS 114
3.10 RECHERCHE ZUR MOEGLICHEN CAMP-ABHAENGIGEN GENREGULATION 115
VON PROTEIN-PHOSPHATASE-UNTEREINHEITEN
4. DISKUSSION 116
4.0 BEWERTUNG DER KOCHSALZ-BEHANDELTEN KONTROLLGRUPPEN 117
4.1 DIE AUSSCHALTUNG VON CREM REDUZIERT PROARRHYTHMISCHE EREIGNISSE 118
IN KARDIOMYOZYTEN UND DIE VERSUCHSTIER-STERBLICHKEIT BEI
CHRONISCHER ISOPRENALIN-STIMULATION
4.2 EINE FEHLENDE CREM-FUNKTION HAT KEINEN KRITISCHEN EINFLUSS AUF DIE
121
AKTIONSPOTENTIALDAUER UND DAS ELEKTROKARDIOGRAMM
4.3 DAS FEHLEN VON CREM BEEINFLUSST DIE CA2+-TRANSIENTEN-AMPLITUDE SOWIE
125
DIE CA2+-FREISETZUNGS- UND AUFNAHMEGESCHWINDIGKEIT
4.3.1 DAS UNBEHANDELTE CREM-DEFIZIENTE MAUSMODELL ZEIGT INHAERENTE 125
VERAENDERUNGEN DER CALCIUM-DYNAMIK
4.3.2 DAS FEHLEN VON CREM FUEHRT NACH CHRONISCHER ISOPRENALIN-STIMULATION
128
ZU EINER VERLANGSAMTEN CA2+-FREISETZUNG
4.4 VERSTAERKTE PROTEIN-PHOSPHATASE-AKTIVITAET IM CREM-KO-MODELL
VERRINGERT 131
DEN PHOSPHORYLIERUNGSGRAD VON PROTEINEN MIT EINFLUSS AUF DIE
CA2+-DYNAMIK
4.5 DAS CREM-KO-MODELL ZEIGT HINWEISE AUF EINE GERINGERE
DESENSITIVIERUNG 133
GEGENUEBER ISOPRENALIN NACH CHRONISCHER SS-ADRENERGER VORSTIMULATION
4.6 DIE AUSSCHALTUNG VON CREM SCHUETZT NICHT VOR 136
ISOPRENALIN-INDUZIERTER HYPERTROPHIE
4.7 ARRHYTHMIE-UNTERSUCHUNGEN MITTELS ELEKTROKARDIOGRAMM UND 138
BEWERTUNG DER METHODE
4.8 AUSBLICK 139
5. ZUSAMMENFASSUNG 142
6. LITERATUR 144
DANKSAGUNG 158
LEBENSLAUF 159
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