Verfügbarkeit: Funktions- und Inhibitionsuntersuchungen zu den von SLC22A1, SLC22A2 und SLC6A4 kodierten Transportproteinen OCT1, OCT2 und SERT

Funktions- und Inhibitionsuntersuchungen zu den von SLC22A1, SLC22A2 und SLC6A4 kodierten Transportproteinen OCT1, OCT2 und SERT:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Hacker, Kristina (VerfasserIn)
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Veröffentlicht:	Erlangen ; Nürnberg [2018]
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.................................................................................... VII 1. ZUSAMMENFASSUNG..........................................................................................1 2. SUMMARY........................................................................................................... 7 3. EINLEITUNG........................................................................................................ 13 3.1 EINFLUSS VON TRANSPORTPROTEINEN AUF DIE PHARMAKOKINETIK UND WIRKUNG VON ARZNEISTOFFEN........................................................................................13 3.2 AUFNAHMETRANSPORTER DER SOLUTE-CARRIER-SUPERFAMILIE..............................15 3.2.1 DIE ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTER OCT1 UND OCT2 .................... 16 3.2.1.1 OCT1 (ORGANISCHER KATIONENTRANSPORTER 1, SLC22A1) ................ 17 3.2.1.2 OCT2 (ORGANISCHER KATIONENTRANSPORTER 2, SLC22A2) ................ 18 3.2.2 DER SEROTONINTRANSPORTER (SERT, SCL6A4) ........................................ 18 3.3 TRANSPORTER-VERMITTELTE, KLINISCH RELEVANTE ARZNEIMITTELINTERAKTIONEN ....... 20 3.3.1 OCT 1 -VERMITTELTE ARZNEISTOFFINTERAKTIONEN..........................................21 3.3.2 OCT2-VERMITTELTE ARZNEISTOFFINTERAKTIONEN..........................................23 3.3.3 EMA/FDA-EMPFEHLUNGEN....................................................................25 3.4 PHARMAKOGENETIK DES SEROTONINTRANSPORTERS UND DIE BEHANDLUNG PSYCHIATRISCHER ERKRANKUNGEN...................................................................29 3.4.1 DAS SEROTONERGE SYSTEM.....................................................................29 3.4.2 DER SEROTONINTRANSPORTER ALS ZIELSTRUKTUR FUER ANTIDEPRESSIVA ............. 31 3.4.3 PHARMAKOGENETIK DES SEROTONINTRANSPORTERS.....................................33 4. ZIELE DER VORLIEGENDEN ARBEIT.......................................................................37 5. MATERIAL UND METHODEN................................................................................. 39 5.1 MATERIAL....................................................................................................39 5.1.1 CHEMIKALIEN......................................................................................... 39 5.1.2 TESTSUBSTANZEN...................................................................................42 5.1.3 [3H]-, [14C]- UND NICHT-MARKIERTE CHEMIKALIEN FUER TRANSPORT VERSUCHE ............................................................................................. 47 5.1.4 PUFFER UND LOESUNGEN...........................................................................46 5.1.5 REAKTIONSSYSTEME (KIT SYSTEME) ........................................................ 49 5.1.6 ENZYME............................................................................................... 50 5.1.7 ZELLEN....................................................................................................50 5.1.8 ANTIKOERPER..............................................................................................51 5.1.9 SPEZIFISCHE OLIGONUKLEOTIDPRIMER ........................................................ 52 5.1.10 PLASMIDE.............................................................................................54 5.1.11 GERAETE.................................................................................................54 5.1.12 SOFTWARE UND DATENBANKEN ............................................................... 58 5.1.13 VERBRAUCHSMATERIALIEN.......................................................................60 5.2 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION VON ARZNEISTOFFEN MIT DEN OCTS..........................................................................................................63 5.2.1 ZELLKULTIVIERUNG..................................................................................... 63 5.2.2 QUANTIFIZIERUNG DES GESAMTPROTEINGEHALTS ........................................ 65 5.2.3 TRANSPORTVERSUCHE...............................................................................66 5.2.3.1 AUFNAHMEVERSUCHE........................................................................66 5.2.3.2 INHIBITIONSVERSUCHE........................................................................68 5.2.4 UEBERPRUEFUNG DER SUBSTRATABHAENGIGKEIT DER INTERAKTION DER ARZNEISTOFFE MIT DEN OCTS .................................................................. 69 5.2.5 STATISTISCHE ANALYSE.............................................................................70 5.3 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER PHARMAKOGENETIK DES SEROTONINTRANSPORTERS................................................................................71 5.3.1 ZELLKULTIVIERUNG..................................................................................... 71 5.3.2 AUSWAHL UND BEWERTUNG DER EINZELNUKLEOTID-POLYMORPHISMEN ....... 72 5.3.2.1 DATENBANKEN.................................................................................72 5.3.2.2 VORHERSAGE-PROGRAMME ............................................................... 72 5.3.2.3. IN SILICO MODELLIERUNG VON SERT..................................................73 5.3.3 ETABLIERUNG DER GENETISCH VERAENDERTEN SLC6A4-EXPRESSIONS PLASMIDE .............................................................................................. 74 5.3.3.1 UEBERPRUEFUNG UND AMPLIFIKATION DES PCMV6-ENTRY SLC6A4- EXPRESSIONSPLASMIDS .................................................................... 74 5.3.3.2 MUTAGENESE VON SLC6A4 ............................................................. 74 5.3.3.3 HERSTELLUNG DES PCMV6-ENTRY LEERVEKTORS .................................. 76 5.3.3.4 KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA- UND RNA-LOESUNGEN..............................................................................77 5.3.3.5 DNA-ANALYSE MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE ......................... 77 5.3.4 TRANSFEKTION VON HEK293-ZELLEN FUER DIE TRANSIENTE EXPRESSION VON SERT...................................................................................................78 5.3.5 METHODEN DER RNA-ANALYTIK................................................................79 5.3.5.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA ......................................................... 79 5.3.5.2 UMSCHREIBUNG DER RNA IN CDNA ................................................. 80 5.3.5.3 QUANTITATIVE REALTIME-PCR ......................................................... 80 5.3.6 METHODEN DER PROTEINANALYTIK..............................................................63 5.3.6.1 GESAMTPROTEINISOLIERUNG AUS TRANSIENT TRANSFIZIERTEN HEK293- ZELLEN.............................................................................................83 5.3.6.2 MEMBRANPROTEINISOLIERUNG AUS TRANSIENT TRANSFIZIERTEN HEK293-ZELLEN.............................................................................. 83 5.3.6 3 QUANTIFIZIERUNG DES GESAMTPROTEINGEHALTS..................................84 5.3.6.4 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN (SDS-PAGE) .... 64 5.3.6.5 IMMUNBLOTANALYSE.........................................................................85 5.3.6 6 ENTFERNEN VON ANTIKOERPERN.............................................................87 5.3.6 7 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE ..................................................... 67 5.3.7 TRANSPORTVERSUCHE.............................................................................. 90 5.3.7.1 SEROTONIN-AUFNAHMEVERSUCHE ...................................................... 90 5.3.7.2 INHIBITIONSVERSUCHE.......................................................................91 5.3.8 STATISTISCHE ANALYSE............................................................................ 92 6. ERGEBNISSE................................................................................................... 93 6.1 INTERAKTION VON CA. 125 HAEUFIG VERSCHRIEBENEN ARZNEISTOFFEN MIT DEN HUMANEN ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTERN OCT1 UND OCT2 .............. 93 6.1.1 INTERAKTION VON CA. 125 HAEUFIG VERSCHRIEBENEN ARZNEISTOFFEN MIT DEM ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTER OCT1.....................................93 6.1.1.1 FUNKTIONELLE ANALYSE VON OCT1 ................................................... 93 6.1.1.2 EINFLUSS VON ARZNEISTOFFEN AUF DEN OCT1-VERMITTELTEN MPP+- TRANSPORT....................................................................................... 94 6.1.1.3 SUBSTRATABHAENGIGKEIT DER INTERAKTION DER ARZNEISTOFFE MIT OCT1 ............................................................................................ 97 6.1.1.4 KLINISCHE SIGNIFIKANZ DER OCT1-INHIBITION....................................98 6.1.2 INTERAKTION VON CA. 125 HAEUFIG VERSCHRIEBENEN ARZNEISTOFFEN MIT DEM ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTER OCT2 .................................. 101 6.1.2.1 FUNKTIONELLE ANALYSE VON OC T2................................................. 101 6.1.2.2 EINFLUSS VON ARZNEISTOFFEN AUF DEN OCT2-VERMITTELTEN METFORMIN-T RANSPORT....................................................................103 6.1.2.3 EINFLUSS VON ARZNEISTOFFEN AUF DEN OCT2-VERMITTELTEN MPP+- TRANSPORT ..................................................................................... 105 6.1.2.4 SUBSTRATABHAENGIGKEIT DER INTERAKTION DER ARZNEISTOFFE MIT OCT2............................................................................................107 6.1.2.5 KLINISCHE SIGNIFIKANZ DER OCT2-LNHIBITION .................................. 111 6.1.3 TRANSPORTER-BASIERTE UNTERSCHIEDE BEZUEGLICH DER INTERAKTION MIT DEN ARZNEISTOFFEN............................................................................... 113 6.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHARMAKOGENETIK DES HUMANEN SEROTONINTRANSPORTERS.............................................................................. 114 6.2.1 IDENTIFIZIERUNG VON EINZELNUKLEOTID-POLYMORPHISMEN MIT MOEGLICHEM EINFLUSS AUF DIE PROTEINSTRUKTUR UND -FUNKTION VON SERT ............ .....................................................................................115 6.2.2 UNTERSUCHUNG DER TRANSIENT SERT-WILDTYP ODER SERT-MUTANTEN- EXPRIMIERENDEN HEK293-ZELLINIEN AUF MRNA-EXPRESSION, PROTEINEXPRESSION UND -LOKALISATION..................................................120 6.2.3 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES NICHT-SYNONYMER EINZELNUKLEOTID- POLYMORPHISMEN AUF DIE TRANSPORTAKTIVITAET VON SERT ..................... 124 6.2.4 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES NICHT-SYNONYMER EINZELNUKLEOTID- POLYMORPHISMEN AUF DIE INHIBITION DES SERT-VERMITTELTEN SEROTONIN-TRANSPORTS DURCH ANTIDEPRESSIVA ..................................... 127 7. DISKUSSION................................................................................................. 131 7.1 INTERAKTION HAEUFIG VERSCHRIEBENER ARZNEISTOFFE MIT DEN HUMANEN ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTERN OCT1 UND OCT2 ...... ...................... 131 7.1.1 INTERAKTION DES HUMANEN ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTERS OCT1 MIT HAEUFIG VERSCHRIEBENEN ARZNEISTOFFEN...........................................132 7.1.2 INTERAKTION DES HUMANEN ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTERS OCT2 MIT HAEUFIG VERSCHRIEBENEN ARZNEISTOFFEN...........................................138 7.1.3 KORRELATION DER INTERAKTION DER ARZNEISTOFFE MIT OCT1 UND OCT2... 146 7.2 PHARMAKOGENETIK DES HUMANEN SEROTONINTRANSPORTERS SERT ........... 146 LITERATURVERZEICHNIS.........................................................................................157 TABELLENVERZEICHNIS.........................................................................................181 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................... 183 VEROEFFENTLICHUNGEN..........................................................................................185 DANKSAGUNG.....................................................................................................187
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