The definitive guide to strategic content marketing: perspectives, issues, challenges and solutions
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London ; New York ; New Delhi
Kogan Page
2018
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 3
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 6
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 8
ZUSAMMENFASSUNG 10
SUMMARY 12
1. EINLEITUNG 14
1.1. DAS PHYTOHORMON ABSCISINSAEURE 14
1.1.1. BIOSYNTHESE UND ABBAU VON ABSCISINSAEURE 16
1.1.2. ABSCISINSAEURE-SIGNALTRANSDUKTION 18
1.1.2.1. REGULATION DER STOMATAAPERTUR 23
1.1.2.2. GENEXPRESSIONSREGULATION 26
1.2. SALZSTRESS 29
1.2.1. NACI-AUFNAHME DURCH DIE PFLANZE UND AUSWIRKUNGEN 29
1.2.2. MECHANISMEN DER SALZTOLERANZ IN ARABIDOPSIS 31
1.3. SUCHE NACH ARABIDOPSIS-MUTANTEN MIT GESTOERTER REAKTION AUF
TROCKENHEIT 34 1.3.1. INFRAROTTHERMOGRAPHIE 35
1.3.2. RNA-INTERFERENZ 35
1.4. ABSCISINSAEURE-REZEPTOREN 39
1.4.1. BIS ENDE 2008 BESCHRIEBENE ABSCISINSAEURE-REZEPTOREN IN A.
THALIANA 39 1.4.2. DER CYTOSOLISCHE ABSCISINSAEURE-REZEPTORKOMPLEX 41
1.4.2.1. RCAR-PROTEINE UND DIE BET V 1-SUPERFAMILIE IN A. THALIANA 41
1.4.2.2. RCAR-PROTEINE IN DER ABA-PERZEPTION ALS INTERAKTIONSPARTNER VON
PP2CS... 43
1.5. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 46
2. ERGEBNISSE 47
2.1. SALZSTRESS 47
2.1.1. REPORTERAKTIVIERUNG DURCH ABA 47
2.1.2. REPORTERAKTIVIERUNG DURCH SALZSTRESS 50
2.1.2.1. ZEITLICHES MUSTER DER REPORTERAKTIVIERUNG 51
2.1.2.2. RAEUMLICHES MUSTER DER REPORTERAKTIVIERUNG 52
2.1.3. VERGLEICH DER AUSWIRKUNGEN VON NACI- UND MANNIT-INDUZIERTEM
OSMOTISCHEN STRESS AUF DIE ABA-ANTWORT 56
2.1.4. EINFLUSS VON NACI AUF GENEXPRESSION UND SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE
57 2.1.5. ABA-AKKUMULATION WAEHREND SALZSTRESS 63
2.1.6. EINFLUSS VON ABA AUF DIE SALZTOLERANZ 65
2.2. ETABLIERUNG EINES SCREENS AUF IN DER PERZEPTION VON OSMOTISCHEM
STRESS ODER IN DER ABA-SIGNALTRANSDUKTION GESTOERTE ARABIDOPSIS-MUTANTEN
68
2.2.1. VERHALTEN VON BEKANNTEN ABA-INSENSITIVEN UND -HYPERSENSITIVEN
MUTANTEN 69 2.2.2. ISOLIERUNG UND VERIFIZIERUNG VON KANDIDATEN 74
2.3. CHARAKTERISIERUNG DES CYTOSOLISCHEN ABA-REZEPTORKOMPLEXES 83
2.3.1. OPTIMIERUNG DER EXPRESSION VON ABI2 UND DIVERSEN RCARS IN E. COLI
83 2.3.1.1. PROTEINEXPRESSION IM PQE-SYSTEM 83
2.3.1.2. ETABLIERUNG WEITERER EXPRESSIONSSYSTEME SOWIE PROTEINVERKUERZUNG
85 2.3.1.3. FUNKTION DER RCARS UND EINFLUSS AUF DIE PHOSPHATASEAKTIVITAET
89 2.3.2. REGULATION DER AKTIVITAET VON PHOSPHATASEN DURCH RCARS UND
HOMOLOGE 90 2.3.2.1. REGULATION VON ABI2 DURCH RCAR11 91
2.3.2.2. DIFFERENTIELLE REGULATION UNTERSCHIEDLICHER PHOSPHATASEN DURCH
VERSCHIEDENE RCARS , 96
2.3.2.3. RCAR-HOMOLOGE AUS BIRKE UND ERDBEERE 100
3
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.3. KRISTALLISATION DES ABSCISINSAEURE-REZEPTORKOMPLEXES 108
2.3.3.1. OPTIMIERUNG DER KRISTALLISATIONSBEDINGUNGEN 109
2.3.3.2. AUSWERTUNG DER KRISTALLSTRUKTUR 115
2.3.4. CHARAKTERISIERUNG DER SUPERFAMILIE DER BET V 1-PROTEINE AUS
ARABIDOPSIS 120 2.3.4.1. EINFLUSS VON HORMONEN UND PFLANZENZELLEXTRAKT
AUF DIE INTERAKTION VON BET V 1 PROTEINEN MIT PHOSPHATASEN 123
2.3.4.2. INTERAKTION VON PHOSPHATASEN DES TYPS 2C MIT RCAR-PROTEINEN 125
3. DISKUSSION 130
3.1. FUNKTIONEN DER ABSCISINSAEURE BEI SALZSTRESS 130
3.1.1. DIE ABA-ANTWORT AUF OSMOTISCHEN STRESS 130
3.1.2. LIMITIERTE AKTIVIERUNG VON ABA-ANTWORTEN DURCH SALZSTRESS 132
3.1.3. ANPASSUNG VON ARABIDOPSIS THALIANA AN SALZSTRESS 134
3.2. DER ABA-REZEPTORKOMPLEX 141
3.2.1. FUNKTION DER RCAR-PROTEINE IN DER ABA-SIGNALTRANSDUKTION 141
3.2.2. UNTERSCHIEDE IN ABA-SELEKTIVITAET UND SENSITIVITAET VON
REZEPTORKOMPLEXEN 146 3.2.3. MECHANISMUS DER ABA-BINDUNG DURCH DIE
REZEPTORKOMPLEXE 150 3.2.4. DIE BET V 1-SUPERFAMILIE IN PFLANZEN 157
4. MATERIAL UND METHODEN 165
4.1. PHYSIOLOGISCHE METHODEN 165
4.1.1. PFLANZENMATERIAL UND ANZUCHT 165
4.1.2. SAMENSTERILISATION UND STERILKULTUR 165
4.1.3. SALZSTRESS UND OSMOTISCHER STRESS AN KEIMLINGEN 166
4.1.4. BESTIMMUNG DER REPORTERAKTIVITAET 167
4.1.4.1. LUCIFERASE-AKTIVITAET (IN VIVO IMAGING) 167
4.1.4.2. ENZYMATISCHE GUS-BESTIMMUNG 167
4.1.5. KLONIERUNG DER REPORTERKONSTRUKTE PATHB6::EGFP UND PRD29B::EGFP
169 4.1.6. TRANSIENTE EXPRESSION IN PROTOPLASTEN 169
4.1.7. AGROBAKTERIEN-VERMITTELTE TRANSFORMATION VON ARABIDOPSIS THALIANA
172 4.1.8. MIKROSKOPISCHE VERFAHREN 173
4.1.9. BESTIMMUNG DER SPALTOEFFNUNGSWEITE 174
4.1.10. BESTIMMUNG VON CHLOROPHYLLGEHALTEN 174
4.1.11. ABA-EXTRAKTION UND BESTIMMUNG DER GEHALTE UEBER HPLC-MS/MS 174
4.1.12. AUFREINIGUNG EINES PFLANZENEXTRAKTES AUS ARABIDOPSIS-ZELLKULTUR
175
4.2. INFRAROTTHERMOGRAPHIE BEI PFLANZEN 176
4.2.1. BESTEHENDE RNAI-BIBLIOTHEK 176
4.2.2. INFRAROTTHERMOGRAPHIE 177
4.2.3. ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS ARABIDOPSIS THALIANA 178
4.3. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 179
4.3.1. ESCHERICHIA COLI- STAEMME UND IHRE KULTIVIERUNG 179
4.3.2. HERSTELLUNG CHEMISCH UND ELEKTRO-KOMPETENTER ZELLEN 180
4.3.3. TRANSFORMATION KOMPETENTER MIKROORGANISMEN MIT PLASMID-DNA 180
4.3.4. METHODEN DER DNA-ISOLATION 181
4.3.5. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 182
4.3.6. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND DNA-AUFREINIGUNG 183
4.3.7. VERDAU VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 184
4.3.8. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 185
4.3.9. DNA-SEQUENZIERUNG 185
4.3.10. KLONIERUNGSSTRATEGIEN 185
4.4. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 189
4.4.1. PROTEINEXPRESSION 189
4.4.2. AUFREINIGUNG UND DIALYSE 189
4
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.3. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 191
4.4.4. SILBER- UND COOMASSIE-FAERBUNG 192
4.4.5. WESTERN BLOT 193
4.4.6. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS UND ANTIKOERPER 194
4.4.7. PHOSPHATASE-AKTIVITAETSASSAY 195
4.4.8. MASSENSPEKTROMETRIE: MALDI-TOF NACH IN GEL-DIGESTION 196
4.5. PROTEINKRISTALLISATION 199
4.5.1. KRISTALLISATIONSBEDINGUNGEN UND MIKROSKOPIE 199
4.5.2. ROENTGENSTRUKTURANALYSE 202
4.6. YEAST TWO-HYBRID INTERAKTIONSSCREEN 203
4.6.1. KULTIVIERUNG VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE 203
4.6.2. VERWENDETE PLASMIDE UND KLONIERUNG VON MLPS 204
4.6.3. TRANSFORMATION VON DNA IN HEFEZELLEN 205
4.6.4. PRAEPARATION VON DNA AUS HEFEZELLEN 206
4.6.5. BESTIMMUNG POSITIVER INTERAKTION 207
4.6.5.1. SELEKTION UND TEST DES WACHSTUMSPHAENOTYPS 207
4.6.5.2. SS-GALACTOSIDASE-ASSAY 208
4.7. CHEMIKALIEN UND GERAETE 208
4.7.1. CHEMIKALIEN / REAGENZIEN 208
4.7.2. VEKTOREN, PLASMIDE, OLIGONUKLEOTIDE UND RESTRIKTIONSENZYME 208
4.7.3. GERAETE 209
4.8. IN SILICO- ANALYSE 210
5. ANHANG 212
5.1. OLIGONUKLEOTIDE UND AUSGANGSPLASMIDE 212
5.2. KONSTRUKTE ZUR PROTEINEXPRESSSION 215
5.3. PROTEINSEQUENZEN 220
6. LITERATUR 222
5
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