Molekularbiologische Methoden 2.0:
Gespeichert in:
| Vorheriger Titel: | Reinard, Thomas, 1963- Molekularbiologische Methoden |
|---|---|
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Stuttgart
Verlag Eugen Ulmer
[2018]
|
| Ausgabe: | 2., vollständig überarbeitete und erweiterte Auflage |
| Schriftenreihe: | utb
8449 |
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| Online-Zugang: | Inhaltstext Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 1. Auflage unter dem Titel: Molekularbiologische Methoden Bestellnummer: 8449 |
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INHALT
VORWORT ZUR 1. AUFLAGE
.
12
VORWORT ZUR 2. AUFLAGE
.
13
1
DAS LEBEN UND SEINE BESTANDTEILE
1.1
DER AUFBAU VON DNA
1.4
PROTEINE
.
.
26
UND RNA
.
17
1.5 DIE ZELLE
.
.
30
1.2 DER GENETISCHE CODE
.
20
1.3
DIE GENE .
22
1.3.1
DIE GENSTRUKTUR IN PROKARYOTEN . 22
1.3.2 GENSTRUKTUR IN EUKARYOTEN
.
24
2
GRUNDLAGEN DER ARBEIT IM LABOR
2.1 WASSER
.
34
2.9
PROBENLAGERUNG
.
. 46
2.2
MESSUNG DES PH-WERTS
.
35
2.10
STERILES ARBEITEN
.
. 46
2.3 PUFFER.
, 36
2.11 GERAETE FUER DEN AUFSCHLUSS
VON GEWEBEN
.
. 49
2.4
WAAGEN
.
, 36
2.12 PFLEGE UND AUFZUCHT
2.5 MIKROPIPETTEN
.
, 38
VON
ESCHERICHIA C O L I
. . 51
2.12.1 NAEHRMEDIEN
.
. 52
2.6 GEFAESSE IM LABOR.
. 40
2.12.2 ANTIBIOTIKA
.
. 53
2.12.3 LAGERUNG VON BAKTERIEN
. . 55
2.7 ZENTRIFUGEN.
41
2.8 MISCHEN UND KONZENTRIEREN .
, 44
2.8.1
KONZENTRIEREN
.
, 45
2.8.2
PUFFERWECHSEL
.
45
3 AUFREINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN
3.1 GEGENSPIELER ERFOLGREICHER
DNA- UND RNA-ISOLATIONEN
. . . 59
3.1.1 NUKLEASEN
.
59
3.1.2 SCHERKRAEFTE
.
60
3.1.3 CHEMISCHE VERUNREINIGUNGEN
_
60
3.1.4 EDTA UND ZWEIWERTIGE IONEN:
DAS YIN UND YANG DER
MOLEKULARBIOLOGIE
.
61
3.2 EXTRAKTION VON
NUKLEINSAEUREN
.
62
3.3 DIE WEITERE AUFREINIGUNG
DER D N A
.
64
3.3.1 PHENOLEXTRAKTION
.
64
3.3.2 ETHANOLFAELLUNG
.
65
3.3.3 ISOPROPANOLFAELLUNG
.
67
3.3.4 PEG-FAELLUNG
.
68
3.3.5 ENTFERNEN VON POLYSACCHARIDEN
MIT CTAB
.
68
3.3.6 TROPFENDIALYSE
.
68
3.4 SILICA MATRICES
.
69
3.4.1 VON NUKLEINSAEUREN UND
SILICA MATRICES
.
69
3.4.2 UEBERSICHT UEBER DEN EINSATZ
VON K ITS
.
70
3.5
AUSGEWAEHLTE DNA-
AUFREINIGUNGSVERFAHREN
.
71
3.5.1 DIE PLASMIDPRAEPARATION
AUS
E. C O LI
.
71
3.5.2 DIE ISOLATION VON DNA AUS
PFLANZEN MIT CTAB
.
72
3.5.3 ISOLATION VON DNA AUS BLUT
ODER ZELLKULTUREN
.
74
3.5.4 ISOLATION HOCHMOLEKULARER DNA . 75
3.6
DIE ISOLATION VON RNA
.
76
3.7
TIPPS ZUM ERZIELEN HOHER
AUSBEUTEN BEI DER ISOLATION
VON NUKLEINSAEUREN
.
78
3.8
QUANTIFIZIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN
.
79
3.8.1 DNA-BESTIMMUNG
IM PHOTOMETER
.
79
3.8.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
MITTELS OPTISCHER DICHTE
.
81
4 POLYMERASE-KETTENREAKTION
4.1
PRINZIP DER POLYMERASE-
KETTENREAKTION . 85
4.2
DIE KOMPONENTEN DER PCR
_
86
4.2.1 DIE AUSGANGS-DNA
.
86
4.2.2 THERMOSTABILE DNA-POLYMERASEN. 86
4.2.3 PUFFER, MAGNESIUM UND DNTPS . . . 89
4.2.4 P RIM ER. 91
4.3
GERAETE FUER DIE PCR
.
93
4.4
DIE STANDARD-PCR
.
94
94
94
4.5.2 GRADIENTEN-PCR UND
TOUCH-DOWN PCR
.
96
4.5.3 NESTED PCR
.
97
4.5.4 MULTIPLEX PC R
.
97
4.5.5 EINFUHREN VON
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
.
98
4.5.6 REVERSE TRANSKRIPTIONS-PCR
(RT-PCR). 99
4.5.7 KOLONIE-PCR
.
102
4.5.8 QUANTITATIVE PCR
.
103
4.6 ANWENDUNGEN DER PCR
.
105
OPTIMIERUNG DER
PCR-REAKTION .
4.5 AUSGEWAEHLTE PCR-METHODEN.
4.5.1 TWO-STEP PCR
.
4.7
5
KLONIEREN FUER EINSTEIGER
5.1 RESTRIKTIONSENZYME. 109
5.1.1 RESTRIKTIONSENZYME DES TYPS I I . . 110
5.1.2 RESTRIKTIONSENZYME IM LABOR
-----
113
5.1.3 METHYLASEN UND TYP IIM-ENZYME . 115
5.1.4 TYP IIS-ENZYME
.
116
5.2
LIGATION
.
116
5.3 (DE)PHOSPHORYLIERUNG
VON DNA
.
118
5.3.1 DEPHOSPHORYLIERUNG
.
118
5.3.2 PHOSPHORYLIERUNG
.
119
5.4 ENZYME FUER
SPEZIELLE AUFGABEN
.
121
5.5 DIE TRANSFORMATION
VON E. CO/I
.
121
5.6 DER WEG ZUM MONIERTEN GEN.
123
5.7 DER UNGERICHTETE EINBAU EINER
AMPIIFIZIERTEN DNA IN EINEN
VEKTOR
.
123
5.7.1
DIE KLONIERUNG UEBER EINE
RESTRIKTIONSSTELLE
.
124
5.7.2 TA-KLONIERUNG UND TOPO-CLONING 125
5.7.3 KLONIERUNG IN EIN LETAL-PLASMID .
126
5.7.4
ZYKLISCHE
BLUNT END KLONIERUNG. 126
5.8
DER GERICHTETE EINBAU VON DNA
IN EINEN VEKTOR.
127
5.9
WENN ES MAL NICHT KLAPPT.
129
6 VEKTOREN
6.1
PLASMIDE .
,. 132
6.8
KUENSTLICHE CHROMOSOME:
YACS, BACS UND PACS.
148
6.2
KLONIERUNGSPLASMIDE
.
,.
135
6.2.1
BLAU-WEISS-SCREENING
.
,
.
135
6.9
HEFEN ALS KLONIERUNGS- UND
6.2.2
LETALVEKTOREN
.
,.
138
EXPRESSIONSSYSTEM
.
149
6.9.1
HEFE ALS MODELLORGANISMUS
.
149
6.3
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
.
,. 139
6.9.2 VEKTOREN FUER H E FE
.
151
6.3.1 PROMOTOREN FUER
6.9.3
TRANSFORMATION VON H E FE
.
152
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
,. 140
6.3.2
WEITERE REGULATIVE SEQUENZEN
.
,.
141
6.10
PFLANZEN ALS BIOREAKTOREN
_
152
6.3.3 EXPRESSION IN DAS PERIPLASMA
.
,.
141
6.10.1
DIE TRANSFORMATION VON PFLANZEN
.
153
6.3.4 EINSCHLUSSKOERPERCHEN
6.10.2 TRANSIENTE
[INCLUSION BODIES]
.
,.
141
TRANSFORMATIONSVERFAHREN
.
155
6.3.5
TAG-SEQUENZEN
.
,.
142
6.11
DIE TRANSFORMATION
6.4
REPORTERGENE
.
.
142
VON SAEUGETIEREN UND
TIERISCHEN ZELLKULTUREN
.
156
6.5
PHAGEN
.
,.
146
6.11.1
SAEUGETIERE ALS MODELLORGANISMEN
.
156
6.11.2
SAEUGER-ZELLKULTUREN
.
157
6.6
PHAGEMIDE
.
.
147
6.11.3
VEKTOREN FUER TIERISCHE ZELLEN
.
158
6.11.4
TRANSFEKTION TIERISCHER
6.7 SHUTT/E-VEKTOREN
.
. 147
ZELLKULTUREN
.
159
7 ELEKTROPHORESE UND HYBRIDISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN
7.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 7.5 FEHLERSUCHE BEI AGAROSE-
VON DNA.
. 162
GELELEKTROPHORESE .
. 170
7.2. DIE DETEKTION DER DNA 7.6
HYBRIDISIERUNG VON
IM G EL
.
. 167
NUKLEINSAEUREN
.
. 171
7.6.1
SOUTHERN UND NORTHERN BLOT. .
.
. 173
7.3
PRAEPARATIVE AGAROSEGELE
.
.
169
7.6.2
HERSTELLUNG DER SONDE UND
HYBRIDISIERUNG
.
. 174
7.4
AUFTRENNEN VON RNA
IM AGAROSEGEL.
. 170
7.7
MICROARRAYS
.
. 174
8 FORTGESCHRITTENE KLONIERUNG
8.1
KLONSAMMLUNGEN UND
SYNTHETISCHE GENE
.
. 179
8.6
BIOBRICKS.
189
8.1.1
KLONSAMMLUNGEN
.
. 180
8.7
NAHTLOSE
8.1.2 SYNTHETISCHE GENE UND
KLONIERUNGSVERFAHREN
.
189
GENFRAGMENTE
.
. 180
8.7.1
GOLDEN GATE KLONIERUNG
.
190
REKOMBINASE-BASIERTE
8.7.2
CUT-LIGATION
VERFAHREN.
191
8.2
8.7.3
MULTIPLE INSERTIONEN MITTELS
KLONIERUNG . . 181
8.7.4
GOLDEN GATE KLONIERUNG
.
GOLDEN GATE BASIERTE TOOL KITS AM
192
8.3
MUTAGENESEVERFAHREN
_
. 183
BEISPIEL DES MOCLO KITS.
192
8.4 PCR-BASIERTE
8.8
GIBSON ASSEMBLY
.
195
KLONIERUNGSVERFAHREN:
RF-CLONING UND OEPCR
_
. 186
8.9
VERGLEICH DER VERFAHREN
.
198
9
PROTEINAUFREINIGUNG
9.1
HOMOGENISATION
.
. 203
9.5
QUANTIFIZIERUNG
9.1.1
PROTEASEN
.
. 204
VON PROTEINEN
.
. . . 217
9.1.2
PHENOLOXIDASEN
.
. 206
9.5.1 PROTEINBESTIMMUNG
NACH BRADFORD
.
. . . 217
9.2
EXTRAKTION VON PROTEINEN
_
. 207
9.5.2 BCA-TEST
.
. . . 219
9.2.1
HOMOGENISATIONSPUFFER
.
. 207
9.5.3 WELCHEN TEST BENUTZEN?
.
. . . 220
9.2.2
ABTRENNEN VON ZELL- UND
GEWEBETRUEMMERN
.
. 208
9.6
AUFREINIGUNGSVERFAHREN
9.2.3
FRAKTIONIERUNG DES ROHEXTRAKTS
208
FUER GETAGGTE PROTEINE
AUS E.
C O L I
.
. . . 221
9.3
DIALYSE UND KONZENTRIERUNG
.
.211
9.6.1
BAKTERIENANZUCHT UND
HOMOGENISATION
.
. . . 222
9.4
WEITERE
9.6.2 WEITERE AUFREINIGUNG DES
AUFREINIGUNGSSCHRITTE
.
. 212
HETEROLOGEN PROTEINS
.
. . . 224
9.4.1
CHROMATOGRAPHIE
.
. 213
9.4.2
CHROMATOGRAPHISCHE
TRENNPRINZIPIEN
.
. 215
9.4.3
MAGNEDC BEADS
.
. 216
10 GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
10.1 DIE POLYACRYLAMID-
GELELEKTROPHORESE (PAGE)
.
229
10.2 DIE DENATURIERENDE
SDS-PAGE
.
229
10.2.1 HERSTELLUNG EINES PROTEINEXTRAKTS
FUER DIE SDS-GELELEKTROPHORESE . . . 229
10.2.2 HERSTELLEN DES GELS
.
232
10.2.3 DER GELLAUF
.
235
10.4 WEITERE ELEKTROPHORESE
VERFAHREN FUER PROTEINE
.
239
10.4.1 NATIVE PAGE
.
239
10.4.2 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG
.
239
10.4.3 2-D-GELELEKTROPHORESE
.
239
10.5 WESTERN BLOTTING
.
241
10.6 MASSENSPEKTROMETRISCHE
VERFAHREN.
246
11 IM M U N B IO C H E M IS C H E M E TH O D E N
11.1
ANTIKOERPER
.
. 251 11.3
ELISA.
261
11.3.1 SANDWICH-ELISA.
263
11.2
PRINZIPIEN IMMUN
BIOCHEMISCHER VERFAHREN
_
. 254
11.3.2 KOMPETITIVER ELISA
.
265
11.2.1 IMMUNPRAEZIPITATION
.
. 254
11.4
IMMUNFAERBUNG NACH
266
11.2.2 TRAEGERBASIERTE IMMUNFAERBUNG .
. 256
WESTERN
B LO T
.
11.2.3
IMMOBILISIERUNG DES ANTIGENS .
. 257
IMMUNAFFINITAETS
11.2.4
BLOCKEN UEBERSCHUESSIGER
11.5
BINDESTELLEN
.
. 257
CHROMATOGRAPHIE
.
269
11.2.5
DETEKTION DER BINDUNG
.
. 257
11.2.6 ANTIKOERPER-KASKADEN
.
. 259
11.6 WEITERE ANTIKOERPER
11.2.7
SPEZIFISCHE UND
BASIERTE METHODEN
.
270
UNSPEZIFISCHE BINDUNGEN
.
. 260
11.6.1
REKOMBINANTE ANTIKOERPER
.
270
11.6.2
PHAGE DISPLAY
UND SCFV
.
271
11.6.3 IMMUNHISTOCHEMISCHE VERFAHREN. 273
11.6.4
MARKIERUNG VON ZELLEN
.
274
12 F O RTG ESCH RITTEN E V ERFAH REN
12.1
DNA-SEQUENZIERUNG.
278
12.4
ANALYSE DER GENFUNKTION .
. 286
12.1.1
SEQUENZIERUNG NACH SAENGER
.
278
12.4.1
REVERSE GENETIK UND
12.1.2 HERSTELLEN VON PROBEN FUER
GENE TARGETING
.
. 286
DIE DNA-SEQUENZIERUNG
.
280
12.4.2
RNAI .
. 287
12.4.3
DURCHFUEHRUNG VON
12.2
NEXT GENERATION
SIRNA-EXPERIMENTEN
.
. 288
SEQUENZIERUNG.
281
12.5
GENOM EDITIERUNG.
. 289
12.3
VON DEN *OMICS*
ZUR SYSTEMBIOLOGIE
.
285
13
BIOINFORMATIK
13.1 DATENBANKEN
.
. 296
13.4 SEQUENZSUCHE MIT EINER
SEQUENZ(BLAST)
.
. 300
13.2 DATEIFORMATE
.
,. 298
13.5 BIOINFORMATIK ZUR PLANUNG
13.3
SEQUENZSUCHE ANHAND VON
STICHWOERTERN (ENTREZ)
.
,. 300
DER LABORARBEIT.
. 305
14 ANHANG
A L SICHERHEIT IM LABOR
.
308
A2 DIE 10 GOLDENEN LABORREGELN . 309
A3 DAS LABORBUCH UND
DIE FINALE ARBEIT
.
311
VERZEICHNIS DER
*GUT ZU WISSEN*-B OXEN
.
313
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
314
VERZEICHNIS DER M APS
.
316
VERZEICHNIS DER PROTOKOLLE
.
316
TABELLENVERZEICHNIS
.
317
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
318
SACHVERZEICHNIS
.
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