Molekulare und funktionelle Charakterisierung des MDR1-Systems von Dompfaff, Huhn, Luchs und Wildkatze sowie Modellierung der MDR1-Effluxaktivität durch verschiedene Antiparasitika bei Huhn, Wildkatze, Katze und Hund:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2016
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| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................................................................
I
VERZEICHNIS DER
ABBILDUNGEN................................................................................................................
V
VERZEICHNIS DER
TABELLEN..........................................................................................................................VI
ABKUERZUNGEN................................................................................................................................................
VII
EIN- UND DREIBUCHSTABENCODE DER AMINOSAEUREN
....................................................................
XIII
NUKLEINBASEN (LUPAC CODE)
....................................................................................................
XIII
NOMENKLATUR DER TRANSPORTER
................................................................................................
XIV
NOMENKLATUR DER STABIL TRANSFIZIERTEN ZELLEN UND DER KONTROLLEN
...........................................
XIV
DER GENETISCHE CODE
...............................................................................................................
XV
VORSAETZE IM DEZIMALSYSTEM
....................................................................................................
XV
VERWENDETE EINHEITEN
............................................................................................................
XV
1
EINLEITUNG.................................................................................................................................................
1
1.1 DIE BLUT-HIRN-SCHRANKE
(BHS)...............................................................................................
1
1.1.1 ZELLULAERE BHS
.............................................................................................................
1
1.1.2 MOLEKULARE BHS
.........................................................................................................
3
1.1.3 DIE BHS IM TIERARTLICHEN VERGLEICH
............................................................................
4
1.2 ABC-TRANSPORTER AN DER
BHS................................................................................................
6
1.2.1 PERMEABILITAETS-GLYCOPROTEIN (P-GP) BZW. M ULTIDRUG RESISTANCE
PROTEIN 1 (M D RL)
.....
7
1.2.2 M ULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN (M RP )
.......................................................
16
1.2.3 BREAST CANCER RESISTANCE PROTEIN (BCRP)
..................................................................
17
1.3
TESTSUBSTANZEN.....................................................................................................................20
1.3.1 SUBSTRATE
................................................................................................................
21
1.3.2 REFERENZHEMMSTOFFE
...............................................................................................25
1.3.3 NEUROAKTIVE SUBSTANZEN
..........................................................................................
27
1.3.4 ANDERE
....................................................................................................................
38
1.3.5 IVERMECTIN-UNVERTRAEGLICHKEIT
..................................................................................
41
1.4 ZIELSETZUNG DER
ARBEIT.........................................................................................................50
2
MATERIAL.................................................................................................................................................52
2.1
PRIMER....................................................................................................................................52
2.2
ENZYME.................................................................................................................................
54
2.2.1 HITZEBESTAENDIGE DNA-POLYMERASEN
.........................................................................
54
2.2.3 REVERSE TRANSKRIPTASE
.............................................................................................
55
2.2.4 SONSTIGE ENZYME
.....................................................................................................
55
2.3
LAENGENSTANDARDS.................................................................................................................
55
2.4
LADEPUFFER............................................................................................................................55
2.5 QUANTITATIVE PCR
(QPCR)....................................................................................................
56
2.6
VEKTOREN...............................................................................................................................
56
2.7 KOMPETENTE
ZELLEN..............................................................................................................57
2.8
ZELLLINIEN...............................................................................................................................
57
2.9
GEWEBEPROBEN....................................................................................................................59
2.9.1 W ILDKATZEN
..............................................................................................................
59
2.9.2 VOEGEL
.......................................................................................................................
59
2.9.3 M AEUSE
.....................................................................................................................
59
2.10 PUFFER UND
LOESUNGEN...........................................................................................................
60
2.10.1 NATIVE AGAROSEGELELEKTROPHORESE
...........................................................................
60
2.10.2 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.............................................................................
60
2.10.3 DENATURIERENDE AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.............................................................
61
2.10.4 ZELLKULTUR
.................................................................................................................
61
2.10.5 ANTIBIOTIKA
...............................................................................................................
62
2.10.6 TRANSFORMATION
.......................................................................................................
63
2.10.7 TRANSFEKTION
............................................................................................................
63
2.10.8 TRANSPORTMESSUNGEN MITTELS RADIOAKTIVITAET UND FLUORESZENZ
.................................
63
2.10.9 PROTEINBESTIMMUNG
.................................................................................................
64
2.10.10 ZYTOLOGIE
..................................................................................................................
64
2.10.12 IMMUNHISTOCHEMIE
...................................................................................................
65
2.11 RADIOAKTIV-MARKIERTE
SUBSTANZEN......................................................................................66
2.12
ANTIKOERPER.............................................................................................................................66
2.13
KITS..........................................................................................................................................67
2.14 REAGENZIEN UND
CHEMIKALIEN.............................................................................................
67
2.15
GERAETE....................................................................................................................................
69
2.16
VERBRAUCHSMATERIAL.............................................................................................................
71
2.17 BIOINFORMATISCHE PROGRAMME UND
DATENBANKEN............................................................72
3 M ETHO
DEN.............................................................................................................................................
74
3.1 DNA- UND RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
....................................................................
74
3.2
GELELEKTROPHORESE................................................................................................................74
3.2.1 NATIVE AGAROSEGELELEKTROPHORESE
............................................................................
74
3.2.2 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
..............................................................................75
3.3 ISOLIERUNG UND AUFARBEITUNG VON
RNA..............................................................................
76
3.3.1 PROBENAUFBEREITUNG
................................................................................................
76
3.3.2 ISOLIERUNG VON TOTAL-RNA AUS GEWEBE UND ZELLEN MITTELS TRI REAGENT
...................
77
3.3.3 ISOLIERUNG VON RNA AUS B LUT
....................................................................................
78
3.3.4 DENATURIERENDE AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.............................................................
79
3.3.5 DNASE VERDAU
.........................................................................................................
79
3.3.6 CDNA SYNTHESE AUS TOTAL-RNA UND ZELLLYSATEN
........................................................
80
3.4 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA
(GDNA)................................................................................
81
3.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
.....................................................................................
81
3.5.1 ALLGEMEINES ZUR PRIMERAUSWAHL
..............................................................................
82
3.5.2 VERSCHIEDENE PCR-ANSAETZE
......................................................................................
82
3.5.3 NESTEDPCR
..............................................................................................................
85
3.5.4 KOLONIE-PCR
.............................................................................................................
85
3.5.5 RACE-PCR
................................................................................................................
86
3.5.6 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR
.....................................................................................
88
3.6 AUFREINIGUNG VON
PCR-AMPLIFIKATEN..................................................................................
90
3.6.1 DIREKTE AUFREINIGUNG VON PCR-AMPLIFIKATEN
...........................................................
90
3.6.2 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
...........................................
90
3.7 SEQUENZIERUNG UND AUSWERTUNG DER
CHROMATOGRAMME................................................91
3.8 GENERIERUNG VON A -UEBERHAENGEN
......................................................................................
91
3.9
DNA-KLONIERUNG....................................................................................................................92
3.9.1 KLONIERUNG UEBER LIGATION
..........................................................................................
92
3.9.2 TOPO-KLONIERUNG
.....................................................................................................
93
3.10
TRANSFORMATION.....................................................................................................................93
3.10.1 LB-MEDIUM/ -PLATTEN
...............................................................................................
93
3.10.2 TRANSFORMATION
.......................................................................................................
94
3.11 AUFREINIGUNG VON
PLASMID-DNA..........................................................................................95
3.11.1 AUFREINIGUNG IM MINI-MASSSTAB
...............................................................................
95
3.11.2 PLASMID PRAEPARATION IM MIDI-MASSSTAB
...................................................................
96
3.12 KULTIVIERUNG EUKARYOTISCHER
ZELLEN....................................................................................
97
3.12.1 AUFTAUEN DER ZELLEN
.................................................................................................
97
3.12.2 PASSAGIEREN UND AUSSAEEN DER ZELLEN
.......................................................................
98
3.12.3 EINFRIEREN DER ZELLEN
................................................................................................
99
3.13 TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER
ZELLEN...................................................................................
99
3.13.1 TRANSIENTE TRANSFEKTION
..........................................................................................
99
3.13.2 STABILE TRANSFEKTION
..............................................................................................
100
3.13.3 TETRAZYKLIN-REGULIERTE PROTEINEXPRESSION
..............................................................
101
3.14
FLUORESZENZ-EFFLUXASSAY....................................................................................................102
3.14.1 ANSETZEN DER MESSLOESUNGEN
..................................................................................
103
3.14.2 GRUNDPRINZIP DER EFFLUXMESSUNG
...........................................................................
103
3.14.3 ETABLIERUNG DER EFFLUXMESSUNG
.............................................................................
104
3.14.4 HEMMSTUDIEN
........................................................................................................
106
3.14.5 FLUORESZENZDETEKTION
............................................................................................
106
3.14.6 PROTEINBESTIMMUNG
...............................................................................................
106
3.14.7 AUSWERTUNG
...........................................................................................................
106
3.15 TRANSPORTMESSUNG MIT RADIOAKTIVEM
IVERMECTIN...........................................................108
3.15.1 ANSETZEN DER MESSLOESUNGEN
..................................................................................
108
3.15.2 EFFLUXMESSUNG
.......................................................................................................
108
3.15.3 FLUESSIGKEITSSZINTILLATIONSMESSUNG
..........................................................................
108
3.15.4 PROTEINBESTIMMUNG
...............................................................................................
108
3.15.5 AUSWERTUNG
...........................................................................................................
109
3.16
ZYTOLOGIE.............................................................................................................................
109
3.16.1 INDIREKTE IMMUNZYTOLOGIE M IT M D RL -ANTIKOERPERN
..................................................
109
3.16.2 VERKUERZTE FLUORESZENZZYTOLOGIE IM ANSCHLUSS AN EINEN
FLUORESZENZ-EFFLUXASSAY... 111
3.17
IMMUNHISTOCHEMIE...........................................................................................................111
3.17.1 HERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN
.........................................................................
112
3.17.2 IMMUNHISTOLOGISCHE AUFBEREITUNG UND FAERBUNG
...................................................
112
3.17.3 MIKROSKOPIE
..........................................................................................................
114
4
ERGEBNISSE..........................................................................................................................................
115
4.1
SEQUENZANALYSE..................................................................................................................
115
4.1.1 ERMITTLUNG DES MDR-LESERAHMENS VON WILDKATZE, LUCHS, DOMPFAFF UND
HUHN
.....
115
4.1.2 SCREENING DES MDRL-HOM OLOGS VERSCHIEDENER VOEGEL A UF DIE
REPETITIVE INSERTION DES
DOMPFAFFS
.............................................................................................................
124
4.2 ETABLIERUNG STABILER FCM DRL, CF(-)M DRL, CF(+)MDRL, FSMDRL, IIM
DRL, GGMDR UND PPMDR
HEK-FLPLN
ZELLLINIEN............................................................................................................126
4.2.1 VERGLEICH VON HEK-FLPLN UND MDCKI-FRTZELLEN HINSICHTLICH IHRER
EIGNUNG ALS
EXPRESSIONSMODELL
................................................................................................
126
4.2.2 UEBERPRUEFUNG DER STABILEN ZELLLINIEN
........................................................................
128
4.2.3 NACHWEIS ANDERER EFFLUXTRANSPORTER MITTELS QUALITATIVER PCR
................................
133
4.3 FUNKTIONELLE
MESSUNGEN...................................................................................................134
4.3.1 HEMMSTOFFE ANDERER EFFLUXTRANSPORTER
..................................................................
135
4.3.2 INTERAKTION VERSCHIEDENER ANTIPARASITIKA UND PESTIZIDE M IT DEN FC
M D RL, CF(-)M DRL,
CF(+)M DRL, FS M D RL, GGMDR, PPM DR HEK-FLPLN ZELLLINIEN
........................................
140
4.3.3 TRANSPORTMESSUNG M IT RADIOAKTIVEN SUBSTANZEN
...................................................
152
4.4
IMMUNHISTOCHEMIE............................................................................................................154
5
DISKUSSION............................................................................................................................................157
5.1 EINORDNUNG DER ERMITTELTEN MDRL-SEQUENZEN IN DIE
ABC-TRANSPORTERFAMILIE
..........
157
5.1.1 SEQUENZVERGLEICH FELIDAE
......................................................................................
157
5.1.2 M D RL ODER MDR3 BEI VOEGELN: SEQUENZVERGLEICH UND EINORDNUNG
...........................
157
5.1.3 INSERTION IM AVIAEREN M DR BEI SPEZIES DER SUPERFAMILIE PASSEROIDEA
......................
164
5.2
TRANSPORTMESSUNGEN........................................................................................................
170
5.2.1 EIGNUNG DER HEK-FLPLN ZELLLINIE ALS EXPRESSIONSMODELL
.........................................
171
5.2.2 AKTIVITAET ANDERER EFFLUXTRANSPORTER UND SUBSTRATSPEZIFITAET
..................................
173
5.2.3 TECHNISCHE DURCHFUEHRBARKEIT DER FLUORESZENZ-EFFLUX MESSUNG
.............................
176
5.2.4 EFFLUXFUNKTION DES M D RL VON HUND, KATZE, WILDKATZE, LUCHS, HUHN
UND DOMPFAFF 182
5.2.5 BEWERTUNG VERSCHIEDENER ANTIPARASITIKA UND PESTIZIDE HINSICHTLICH
DER AUSWIRKUNG
AUF DIE M DRL-FUNKTION UNTERSCHIEDLICHER TIERARTEN
...............................................
194
5.3 P-GP
GEHIRNGEWEBEEXPRESSION........................................................................................220
6
ZUSAMMENFASSUNG.........................................................................................................................
225
7 S U M M A R Y
..............................................................................................................................................228
8
LITERATURVERZEICHNIS......................................................................................................................231
9 A N H A N G
..................................................................................................................................................266
9.1 ETABLIERUNG DES FLUORESZENZ-EFFLUXASSAYS
......................................................................
266
9.2 AUSZUG ZUR IVERMECTIN-VERWENDUNG BEI VERSCHIEDENEN VOGELSPEZIES
.......................
276
9.3 VETERINAERMEDIZINISCH GENUTZTE PRAEPARATE BZW. PESTIZIDPRAEPARATE MIT
DEN IN DIESER
ARBEIT VERWENDETEN
TESTSUBSTANZEN..............................................................................
279
9.4 VETERINAERMEDIZINISCH EINGESETZTE KOMBINATIONSPRAEPARATE
.........................................
304
10
DANKSAGUNG.......................................................................................................................................
308
ERKLAERUNG.....................................................................................................................................................310
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