Charakterisierung des cGMP-Signalweges im Nebenhodenund in transfizierten HEK-Zellen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2017
|
| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS...............................................................................................................................
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.....................................................................................................................
IV
1
EINLEITUNG...............................................................................................................................
1
1.1 CYCLISCHES GUANOSINMONOPHOSPHAT (CGMP)
.......................................................................
1
1.1.1 GENERIERUNG VON CGMP DURCH MEMBRANSTAENDIGE
GUANYLATZYKLASEN...................................1
1.1.2 GENERIERUNG VON CGMP DURCH *LOESLICHE* GUANYLATZYKLASEN
...............................................
4
1.1.3 REGULATION DER ZELLULAEREN CGMP-SPIEGEL DURCH PHOSPHODIESTERASEN
...................................
5
1.1.4 REGULATIONSMECHANISMEN AUSSERHALB DER
ZELLE.......................................................................11
1.1.4.1 N
PRC.......................................................................................................................................
12
1.1.4.2 N E
P..........................................................................................................................................
12
1.1.5 ZIELPROTEINE FUER CGM
P.............................................................................................................
13
1.1.5.1 CGMP-ABHAENGIGE PROTEINKINASE PK G
.................................................................................
14
1.1.6 PHYSIOLOGISCHE EFFEKTE VON CGM
P........................................................................................15
1.2 DER NEBENHODEN ALS ZIELORGAN FUER CGMP-VERMITTELTE EFFEKTE
.............................................
17
1.2.1 AUFBAU UND FUNKTION DES
NEBENHODENS.................................................................................17
1.2.2 FUNKTIONELLE BEDEUTUNG VON CGMP-SIGNALWEGEN IM NEBENHODEN
.....................................
19
1.3 KOMPARTMENTALISIERUNG UND TRANSLOKATION VON CGMP-SIGNALPROTEINEN:
EIN NEUER ASPEKT DER
GRUNDLAGENFORSCHUNG..........................................................................20
1.4 ZIELSETZUNG DER A
RBEIT............................................................................................................
23
2 MATERIAL UND M
ETHODEN........................................................................................................
25
2.1
MATERIAL.....................................................................................................................................25
2.1.1 ALPHABETISCHE LISTE DER VERWENDETEN CHEMIKALIEN
..............................................................
25
2.1.2
ANTIKOERPER.................................................................................................................................28
2.1.2.1
PRIMAERANTIKOERPER.....................................................................................................................
28
2.1.2.2
SEKUNDAERANTIKOERPER.................................................................................................................
29
2.1.3 TIERMATERIAL UND
HEK-ZELLEN................................................................................................
29
2.1.3.1 NEBENHODEN,
RATTE...................................................................................................................
29
2.1.3.2
HEK-ZELL-MATERIAL...................................................................................................................
29
2.1.4 ALPHABETISCHE LISTE DER VERWENDETEN APPARATUREN / UTENSILIEN / G
ERAETE
.............................
30
2.2
METHODEN...................................................................................................................................
31
2.2.1
PROTEINPRAEPARATION.....................................................................................................................31
2.2.1.1 VERWENDETE REAGENZIEN, PUFFER UND
LOESUNGEN.....................................................................
31
2.2.1.2 HERSTELLUNG VON CYTOSOLISCHEN UND
MEMBRANPROTEIN-FRAKTIONEN.........................................32
2.2.2 WESTERN B
LOT..............................................................................................................................32
2.2.2.1 VERWENDETE REAGENZIEN, PUFFER UND
LOESUNGEN.....................................................................
32
2222
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG.............................................................................................................
34
2.2.3
CROSSLINKING..............................................................................................................................
36
2.2.3.1 VERWENDETE REAGENZIEN, PUFFER UND
LOESUNGEN.....................................................................
36
2.2.3.2
VERSUCHSDURCHFUHRUNG.............................................................................................................
37
2.2.4 GUANYLATZYKLASE-ASSAYS (NACHWEIS VON CGMP-GENERIERENDEN
AKTIVITAETEN)
.....................
38
2.2.4.1 VERWENDETE REAGENZIEN, PUFFER UND
LOESUNGEN.....................................................................
38
2.2.4.2
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG.............................................................................................................
39
2.2.5 CGMP-PDE-ASSAY (NACHWEIS VON CGMP-DEGRADIERENDEN AKTIVITAETEN)
............................
40
2.2.5.1 VERWENDETE LOESUNGEN
.............................................................................................................40
2.2.5.2 VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
............................................................................................................
42
2.2.6 CGMP -ELISA (BESTIMMUNG VON CGMP-KONZENTRATIONEN)
...............................................
43
2.2.6.1 VERWENDETE REAGENZIEN, PUFFER UND LOESUNGEN
.................................................................... 43
2.2.6.2
VERSUCHSDURCHFUHRUNG.............................................................................................................
44
2.2.7
DATENANALYSE..............................................................................................................................44
3
ERGEBNIS.....................................................................................................................................
45
3.1 CHARAKTERISIERUNG VON CGMP-SIGNALWEGEN IM NEBENHODEN DER R ATTE
................................
45
3.1.1 UNTERSUCHUNGEN ZU REGION-SPEZIFISCHEN BESONDERHEITEN AUF EBENE DER
PROTEINSPIEGEL... 45
3.1.2 REGIONALE EINFLUESSE AUF DIE SUBZELLULAERE LOKALISATION EINIGER
PROTEINFAKTOREN...................48
3.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR SUBZELLULAEREN LOKALISATION VON PROTEINEN DES GMP
SIGNALWEGES
IN EINEM
ZELLKULTURMODELL.......................................................................................................
49
3.2.1 TRANSFIZIERTE HEK-ZELLEN ALS MODELL SYSTEM
........................................................................
49
3.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER TRANSFIZIERTEN
ZELLEN............................................................................50
3.2.3 EINFLUSS AUF PKG I
...................................................................................................................
53
3.2.4 EFFEKTE AUF SG C
........................................................................................................................
55
3.2.5 EFFEKTE AUF CGMP-DEGRADIERENDE PHOSPHODIESTERASEN
.........................................................
58
3.2.5.1 ANALYSE DER PDE
5-PROTEINSPIEGEL..........................................................................................59
3.2.5.2 CHARAKTERISIERUNG DER CGMP-DEGRADIERENDEN AKTIVITAET
.......................................................
61
3.2.5.3 VORVERSUCHE ZUR
METHODIK......................................................................................................
61
3.2.5.4 ANALYSE DER TOTALEN CGMP-DEGRADIERENDEN AKTIVITAET
...........................................................
66
3.2.5.5 CHARAKTERISIERUNG DER ROLLE VON PDE 5
.................................................................................
67
3.2.5.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR ROLLE VON PDE
1-3.................................................................................
69
3.2.6 SPEZIFITAET DER DURCH NPR-A-TRANSFEKTION ERZEUGTEN EFFEKTE
...............................................
72
4
DISKUSSION................................................................................................................................73
4.1 CGMP-SIGNALWEGE IM NEBENHODEN: REGIONALE UNTERSCHIEDE
...........................................
73
4.2 UNTERSUCHUNGEN ZU CGMP-SIGNALWEGEN IN TRANSFIZIERTEN HEK-ZELLEN
...............................
79
4.2.1 EINFLUSS DER UEBEREXPRESSION VON NPR-A AUF PKG I
.............................................................. 79
4.2.2 REDUKTION VON SGC DURCH NPR-A
UEBEREXPRESSION...............................................................81
4.2.3 EFFEKTE DURCH UEBEREXPRESSION VON
NPR-C.............................................................................83
4.2.4 EINFLUSS DER UEBEREXPRESSION VON NPR-A AUF CGMP-DEGRADIERENDE PDES
..........................
84
5
ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................86
6
SUMMARY.................................................................................................................................
87
7
LITERATURVERZEICHNIS..............................................................................................................
88
8 ERKLAERUNG
...............................................................................................................................
100
9
PUBLIKATIONEN..........................................................................................................................
101
10
DANKSAGUNG.............................................................................................................................102
|
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