Ausbreitungs- und Persistenzstrategien des Virus der Bornaschen Krankheit in primären corticalen Astrozytenkulturen von Lewis-Ratten:
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Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2016
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 3
2 1 ASTROZYTEN 3
211 Physiologische Bedeutung von Astrozyten 3
2111 Astrozytendifferenzierung in vivo 5
2112 Astrozytenreifung in vivo 7
212 Pathophysiologische Bedeutung von Astrozyten 9
213 Primäre Astrozytenkulturen 11
2 2 BORNASCHE KRANKHEIT 12
221 Wirtsspektrum, Reservoir und geographische Ausbreitung 13
222 Klinik bei natürlich infizierten Tieren 16
223 Klinik bei experimentell infizierten Lewis-Ratten 16
224 Übertragung und Infektionsweg 18
225 Pathogenese 18
2 3 BORNA DISEASE VIRUS (BDV) 19
231 Aufbau des Virus 19
232 Genomorganisation und Regulation der Genexpression 20
233 Proteine des BDV 23
2331 Hüllproteine (BDV-M, BDV-GP) 23
2332 Proteine des Ribonukleoproteinkomplexes (BDV-N, BDV-P, BDV-L und BDV-X) 26
234 Infektionszyklus 29
235 Ausbreitung behüllter Viren 32
2351 Allgemeines zur Ausbreitung behüllter Viren 32
2352 BDV-Ausbreitung in Zellkulturen 33
236 Persistenzmechanismen 34
2 4 ZELLTROPISMUS DES BDV 36
241 Astrozyten 36
242 Neurone, Oligodendrozyten und andere Gehirnzellen 37
243 Neonatale Infektion von Epithelzellen 37
2 5 ANTIVIRALE INTERVENTIONSSTRATEGIEN 38
251 Prophylaxe- und Therapieansätze bei Bomascher Krankheit 38
252 Furin und Furin-Inhibitor MI-0701 39
2521 Furin und andere Subtilisin-ähnliche Pro-Protein-Konvertasen (SPCs) 39
2522 SPC-Inhibitoren und der Furin-Inhibitor MI-0701 40
INHALTSVERZEICHNIS
3 MATERIAL UND METHODEN 42
3 1 VERSUCHSPLANUNG 42
3 2 VERSUCHSTIERE 43
321 Tiere zur Präparation primärer corticaler Astrozytenkulturen 43
322 Kontrolliere 43
3 3 IN VITRO KONTROLLMATER1AL 44
3 4 VIRUSPRÄPARATION 44
3 5 ALLGEMEINE VIROLOGISCHE ARBEITSSCHRITTE 44
3 6 PRÄPARATION UND BDV-INFEKTION PIMÄRER CORTICALER ASTROZYTEN 45
361 Optimierung der Präparationsmethode 45
362 Präparation 45
363 Reinheit der Astrozytenkulturen 48
364 BDV-Infektion 48
3 7 ZELLKULTURTECHNIK 49
371 Medienwechsel 49
372 Subkultur adhärenter Zellen (Passagieren) 49
373 Einfrieren von Zellen 50
374 Auftauen von Zellen 50
375 DAPI-Test zum Nachweis von Mycoplasmen 51
3 8 GEWINNUNG VON UNTERSUCHUNGSMATERIAL 51
381 Material für Indirekte Immunfluoreszenz (IF) 51
3811 Vorbehandlung der Multitest-Objektträger und Deckgläschen 51
3812 Aussäen der Zellen auf Multitest-Objektträgem und 24-Well Platten 51
382 Herstellung von Gefrierschnitten 52
383 Material für Fluoreszenz-In-situ-Hybridisiemng (FISH) 52
384 RNA- und Proteinlysate für real-time PCR (qPCR) und Western Blot (WB) 52
385 Zellkulturüberstand zum Nachweis von infektösem BDV 53
3 9 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ (IF) 53
391 Etablierung unterschiedlicher Fixierungsmethoden 53
392 Seren und Antikörper 53
393 Nachweis astrozytärer Reifungs- und Differenzierungsmarker 56
394 Nachweis von BDV-N, BDV-M und BDV-GP 57
395 Nachweis astrozytärer Reifungs- und Differenzierungsmarker und BDV-N auf 24-Well
Platten 57
396 Kontrollen der indirekten Immunfluoreszenz 58
397 Auswertung der indirekten Immunfluoreszenz 58
INHALTSVERZEICHNIS
3 10 WESTERN BLOT (WB) 59
3 10 1 Lektinpräzipitation 60
3 10 2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford 60
3 10 3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 61
3 10 4 Transfer von Proteinen auf eine Blottingmembran (Western Blot) 61
3 10 5 Immunodetektion von Proteinen auf Blottingmembranen 62
3 10 5 1 Immunodetektion auf PVDF-Membranen 63
3 10 5 2 Immunodetektion auf Nitrozellulose-Membranen 63
3 10 6 Chemilumineszenzdetektion 64
3 10 7 Kontrollen des Western Blots 64
3 11 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (ISH) 64
3 11 1 Sondenherstellung 65
3 11 2 Durchführung der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) 66
3 11 3 Kontrollen der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung 68
3 11 4 Auswertung der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung 68
3 12 REAL-TIME PCR (qPCR, quantitative PCR) 69
3 12 1 Herstellung der Standardverdünnungsreihen 69
3 12 1 1 PCR zur Amplifikation der spezifischen Plasmid-Inserts 69
3 12 1 2 Aufreinigung der DNA und photometrische Messung 71
3 12 1 3 Bestimmung der DNA-Kopienzahl 71
3 12 2 Spezifische Reverse Transkription (spezifische RT) 71
3 12 3 Real-time PCR 75
3 12 4 Reaktionsansatz für die real-time PCR 75
3 12 5 Kontrollen für die real-time PCR 76
3 12 6 Quantifizierung und Normalisierung der Genexpression 77
3 13 INFEKTIOSITÄT DES ZELLKULTURÜBERSTANDES 77
3 14 UNTERSUCHUNG DER ROLLE DES GLYKOPROTEINS BEI DER GLIA-GLIALEN
BDV-AUSBREITUNG 78
3 14 1 Versuchsaufbau 78
3 14 2 Kontrollen des Ausbreitungsversuchs 79
3 14 3 Auswertung des Ausbreitungsversuchs 79
3 15 STATISTIK 79
4 ERGEBNISSE 81
4 1 ETABLIERUNG UND OPTIMIERUNG DER PRIMÄREN CORTICALEN
ASTROZYTENKULTUREN 81
411 Morphologie der primären corticalen Astrozyten 81
412 Zusammensetzung der Zellkulturen 81
INHALTSVERZEICHNIS
413 Einfluss der Präparationsmethode auf die Zellausbeute 82
414 Geeignete Zellkultursysteme für primäre corticale Astrozyten 82
415 Etablierung der geeigneten Fixierungsmethode für den Nachweis der BDV-spezifischen
Antigene 84
4151 Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) 84
4152 Fixierung mit Aceton 85
416 Kryokonservierung und Langzeitlagerung der primären corticalen Astrozyten 85
417 Untersuchung auf Mycoplasmen 85
4 2 NACHWEIS DER ASTROZYTENREIFUNGS- UND DIFFERENZIERUNGSMARKER
MITTELS INDIREKTER IMMUNFLUORESZENZ 85
421 Zusammenfassung der Ergebnisse des Nachweises der Astrozytenreifungs- und
differenzierungsmarker-Expression mittels indirekter Immunfluoreszenz 86
422 Astrozytenreifung 87
4221 GFAP-Expression 87
4222 Vimentin-Expression 88
4223 SlOOß-Expression 89
4224 Nestin-Expression 89
4225 A2B5-Expression 90
423 Astrozytendifferenzierung 92
4231 GLAST-Expression 92
4232 GLT-1-Expression 92
424 BDV-Infektion 94
4 3 NACHWEIS VON BDV-SPEZIFISCHEN ANTIGENEN MITTELS INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ 95
431 Nachweis und Ausbreitung der BDV-Infektion in primären corticalen Astrozytenkulturen95
432 Zusammenfassung der Ergebnisse des Nachweises von BDV-N, BDV-M und BDV-GP
mittels Indirekter Immunfluoreszenz 95
433 Nachweis von BDV-N 97
434 Nachweis von BDV-M 98
435 Nachweis von GFAP 98
4 4 NACHWEIS VON BDV-SPEZIFISCHEN ANTIGENEN MITTELS WESTERN BLOT 98
441 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford 99
442 Nachweises von BDV-N, BDV-M und BDV-GP 99
443 Nachweis von ß-Actin und GFAP 100
4 5 NACHWEIS VON BDV-RNA MITTELS FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
(FISH) 100
451 Zusammenfassung der Ergebnisse der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung 100
452 Nachweis von BDV-N mRNA (BDV-N -1-ssRNA) 102
INHALTSVERZEICHNIS
453 Nachweis von BDV-M mRNA (BDV-Intron-I +ssRNA) 102
454 Nachweis von BDV-GP mRNA (BDV-Intron II +ssRNA) 102
455 Nachweis von genomischer BDV-N vRNA (BDV-N genRNA, BDV-N -ssRNA) 103
4 6 NACHWEIS VON BDV-RNA MITTELS REAL-TIME PCR (qPCR) 103
461 Sensitivität und Spezifität der Real-time PCR 103
462 Referenzgene GAPDH, SDHS, HPRT 104
463 Zusammenfassung der Ergebnisse des Nachweises BDV-spezifischer Transkripte 105
464 Nachweis der BDV-spezifischen Transkripte 106
4641 BDV-N-spezifische Transkripte (BDV-N mRNA, BDV-N +ssRNA) 106
4642 BDV-M-spezifische Transkripte (BDV-M mRNA, BDV-Intron I +ssRNA) 107
4643 BDV-GP-spezifische Transkripte (BDV-GP mRNA, BDV-Intron II +ssRNA) 107
4 7 KORRELATION DER ERGEBNISSE DER BDV-PROTEIN- UND m-RNA-NACHWEISE
107
471 Korrelation der Ergebnisse zum Nachweis von BDV-Proteinen (IF und WB) 107
472 Korrelation der Ergebnisse zum Nachweis von BDV mRNA (FISH und qPCR) 108
473 Korrelation der Ergebnisse zum Nachweis von BDV-Proteinen und BDV mRNA (IF+WB
und FISH+qPCR) HO
4 8 UNTERSUCHUNG DER INFEKTIOSITÄT DES ZELLKULTUR-ÜBERSTANDES BDV-
INFIZIERTER PRIMÄRER ASTROZYTEN MITTELS IF 112
4 9 UNTERSUCHUNG DER ROLLE DES BDV-GLYKOPROTEINS BEI DER GLIA-GLIALEN
BDV-AUSBREITUNG 112
491 Einfluss des Furin-Inhibitors MI-0701 auf die Ausbreitung der BDV-Infektion 113
492 Zellmorphologie nach Behandlung mit MI-0701 114
4 10 FOTOGRAFISCHE DOKUMENTATION DER ERGEBNISSE 115
5 DISKUSSION 125
5 1 ETABLIERUNG UND EIGNUNG DER ASTROZYTENKULTUREN 126
5 2 ASTROZYTENREIFUNGS- UND DIFFERENZIERUNGSMARKER 131
521 Astrozytenreifung 131
522 Astrozytendifferenzierung 136
523 Einfluss der BDV-Infektion auf Astrozytenreifung und -differenzierung 137
5 3 EINSATZ UND GRENZEN PRIMÄRER CORTICALER ASTROZYTEN AM BEISPIEL
DER UNTERSUCHUNG DER BDV-AUSBREITUNG 138
5 4 AUSBREITUNG UND EXPRESSION VON BDV PROTEINEN UND RNA IN PRIMÄREN
CORTICALEN ASTROZYTEN 141
541 Expression von BDV-N, BDV-M und BDV-GP 142
542 Expression von BDV-N mRNA, BDV-M mRNA, BDV-GP mRNA und BDV-N vRNA 145
543 Korrelation der viralen Transkription und Proteinexpression 148
544 Ausbreitungsstrategien des BDV 150
INHALTSVERZEICHNIS
5441 Untersuchung der Infektiosität des Zellkulturüberstandes 150
5442 Rolle des BDV-Glykoproteins bei der glia-glialen Ausbreitung 151
5 5 PERSISTENZMECHANISMEN DES BDV 154
5 6 SCHLUSSBETRACHTUNG 157
6 ZUSAMMENFASSUNG 159
7 SUMMARY 164
8 LITERATURVERZEICHNIS 168
9 ANHANG 200
9 1 BEZUGSQUELLEN FÜR GERÄTE UND SOFTWARE 200
9 2 BEZUGSQUELLEN FÜR REAGENZIEN, KITS, ANTIKÖRPER UND EINMAL WAREN 201
9 3 LÖSUNGEN UND PUFFER 206
931 Zellkultur 206
932 Indirekte Immunfluoreszenz 207
933 Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) 208
934 RNA- und Proteinisolierung, Lektinpräzipitation und Western Blot 213
935 RT, Real-time PCR und Gelelektrophorese 216
9 4 TABELLEN 217
9 5 ABBILDUNGEN 234
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| spelling | Kehr, Kristine Verfasser (DE-588)1104146932 aut Ausbreitungs- und Persistenzstrategien des Virus der Bornaschen Krankheit in primären corticalen Astrozytenkulturen von Lewis-Ratten eingereicht von Kristine Kehr, Karlsruhe Gießen, Lahn VVB Laufersweiler Verlag 2016 V, 246 Seiten Illustration txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Edition Scientifique Dissertation Justus-Liebig-Universität Gießen 2016 cabi Borna disease virus cabi viruses cabi persistence cabi propagation Doktorarbeit Uni Wissenschaft (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content VVB LAUFERSWEILER Verlag (DE-588)1065553803 pbl HEBIS Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=030368620&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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