Die Rolle des olfaktorischen Epithels in der initialen Phase der Infektion mit dem neurotropen Borna disease virus:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2016
|
Schriftenreihe: | Edition Scientifique
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | VI, 256 Seiten 21 cm x 14.6 cm, 358 g |
ISBN: | 9783835964440 3835964445 |
Internformat
MARC
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adam_text | 1.
EINLEITUNG.............................................................................................................................
1
2.
LITERATURUEBERSICHT........................................................................................................
3
2.1 VIRALE EINTRITTSPFORTEN UND STRATEGIEN ZUR AUSBREITUNG INS ZNS .. 3
2.1.1 HAEMATOGENE INFEKTION DES Z N S
.................................................................................3
2.1.1.1 INFEKTION VON
ENDOTHELZELLEN................................................................................3
2.1.1.2 PERMEABILITAETSSTOERUNG DER
BLUT-HIRNSCHRANKE.....................................................4
2.1.1.3 LEUKOZYTENMIGRATION (LEUKOCYTE
TRAFFICKING)........................................................4
2.1.1.4. UEBERTRITT VON VIREN UEBER DEN PLEXUS CHOROIDEUS
...............................................
5
2.1.2 NEUROGENE INFEKTION DES
ZNS....................................................................................
5
2.1.2.1 EINTRITT UEBER SENSORISCHE
NERVEN..........................................................................5
2.1.2.2 EINTRITT UEBER MOTORISCHE
NERVEN...........................................................................5
2.1.2.3 INTRANASALE INFEKTION DES ZNS UEBER OLFAKTORISCHE LEITUNGSBAHNEN
....................
6
2.1.3 VIREN, DIE VERSCHIEDENE INFEKTIONSWEGE
NUTZEN........................................................9
2.1.4 AUFNAHME ANDERER POTENTIELL SCHAEDLICHER AGENTIEN UEBER DAS
OLFAKTORISCHE EPITHEL 10
2.2 AUFBAU DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS..............................................................10
2.2.1 ZELLEN DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS.............................................................................
11
2.3 DIE BORNASCHE
KRANKHEIT.......................................................................................16
2.3.1
KLINIK............................................................................................................................
16
2.3.2 DIE NATUERLICHE INFEKTION DES
PFERDES..........................................................................
17
2.3.3
EPIDEMIOLOGIE..............................................................................................................18
2.3.3.1 WIRTSSPEKTRUM VON
BORNAVIREN............................................................................
18
2.3.3.2 VERBREITUNG DER KLASSISCHEN BORNASCHEN KRANKHEIT
........................................
19
2.3.3.3 BORNAVIRUS-INFEKTION DES
MENSCHEN...................................................................20
2.3.3.4 RESERVOIRE VON
BORNAVIREN.................................................................................
21
2.3.4 TIERMODELLE ZUR UNTERSUCHUNG VON
BORNAVIRUS-INFEKTIONEN....................................22
2.3.4.1 DIE INTRAZEREBRALE INFEKTION NEONATALER
RATTEN.................................................23
2.3.4.2 DIE INTRAZEREBRALE INFEKTION ADULTER
RATTEN....................................................... 24
2.3.4.3 DIE INTRANASALE INFEKTION ADULTER RATTEN
............................................................
27
2.3.4.4 DIE INTRAZEREBRALE INFEKTION VON MAEUSEN
..........................................................
26
2.3.5
BORNAVIREN...................................................................................................................29
2.3.5.1 VIRUSAUFBAU UND GENOMORGANISATION
................................................................
30
2.3.5 2 DIE PROTEINE DES
BDV......................................................................................33
2.3.5.3 DER INFEKTIONSZYKLUS DES
BDV.............................................................................36
2.3.5.4 VIRUSAUSBREITUNG IN VIVO UND IN
VITRO.................................................................
40
3. MATERIAL UND
METHODEN...............................................................................................42
3.1 CHARAKTERISIERUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS DES PFERDES
..
42
3.1.1 PROBENGEWINNUNG UND AUFBEREITUNG DER
PROBEN.....................................................42
3.1.2 HISTOPATHOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG.............................................................................44
3.1.2.1 QUANTITATIVE AUSWERTUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS DES PFERDES
.................
44
3.1.2.2 UNTERSUCHUNG UND QUANTITATIVE AUSWERTUNG DER TYPEN DES
OLFAKTORISCHEN
EPITHELS DES
PFERDES........................................................................................................
45
3.1.3 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER PFERDENASEN
..............................................
46
3.1.3.1 SEREN UND
PRIMAERANTIKOERPER................................................................................
47
3.1.3.2 TERTIAERANTIKOERPER UND
DETEKTIONSSYSTEME..........................................................
49
3.1.3.3 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON OMP (OLFACTORY MARKER
PROTEIN)............49
3.1.3.4 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON DCX (DOUBLECORTIN)
................................
51
3.1.3.5 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON PC NA
(PROLIFERATING CELL NUCLEAR
ANTIGEN)..................................................................................52
3.1.3.6 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON TRKA (TYROSINKINASE-REZEPTOR-A)
.........
52
3.1.3.7 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS WEITERER MARKER
.............................................
53
3.1.3.8 SEMIQUANTITATIVE AUSWERTUNG DER IMMUNHISTOLOGIE
.........................................
54
3.1.4 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER
RATTENNASE................................................55
3.1.5 STATISTISCHE DATENANALYSE DER CHARAKTERISIERUNG DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS
.....
56
3.2 EXPERIMENTELLE INTRANASALE INFEKTION VON LEWIS-RATTEN
..................
56
3.2.1 HERSTELLUNG DER VIRUSSUSPENSION UND DER MOCK-GEHIRNSUSPENSION
......................
56
3.2.1.1
VERSUCHSTIERE........................................................................................................
56
3.2.1.2
VERSUCHSBEDINGUNGEN.........................................................................................
57
3.2.1.3
BDV-INFEKTION........................................................................................................
57
3.2.1.4 EUTHANASIE UND
SEKTION.......................................................................................
57
3.2.1.5 HERSTELLUNG DER
VIRUSSUSPENSION........................................................................
58
3.2.2 INTRANASALE INFEKTION ADULTER LEWIS-RATTEN
..............................................................
56
3.2.2.1
VERSUCHSTIERE........................................................................................................
58
3.2.2.2 VERSUCHSBEDINGUNGEN FUER DIE
/N-W VO-VERSUCHE................................................56
3.2.2.3 BDV-INFEKTION DER
VERSUCHSTIERE.........................................................................
56
3.2.2.4
MOCK-INFEKTION.......................................................................................................59
3.2.2.5 EUTHANASIE UND
SEKTION.......................................................................................
59
3.2.2.6 GEWINNUNG UND AUFARBEITUNG DES PROBENMATERIALS
.........................................
59
3.2.3 HISTOPATHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER
VERSUCHSTIERE...............................................61
3.2.3.1 H&E-FAERBUNG VON GEHIRN UND NASE DER VERSUCHSTIERE
...................................
61
3.2.3.2
AUSWERTUNG...........................................................................................................
61
3.2.4 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER
VERSUCHSTIERE.............................................61
3.2.4.1 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON BDV-N
......................................................
61
3.2.4.2 AUSWERTUNG DER
IMMUNHISTOLOGIE........................................................................
62
3.2.5 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DES PROLIFERATING CELL NUCLEAR
ANTIGEN (PCNA)
BEI BDV-INFIZIERTEN UND MOCK-INFIZIERTEN LEWIS-RATTEN
......................................................
63
3.2.5.1
AUSWERTUNG...........................................................................................................
63
3.2.6 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG DER VERSUCHSTIERE (ISH)
.........................................................
63
3.2.6.1
SONDENHERSTELLUNG...............................................................................................
64
3.2.6.2 DURCHFUEHRUNG DER ISH ZUM NACHWEIS DER VIRALEN
RNA...................................67
3.2.6.3 ISH DER NASEN UND GEHIRNE DER INTRANASAL INFIZIERTEN RATTEN
.........................
68
3.2.6.4 AUSWERTUNG DER
ISH.............................................................................................
66
3.2.7 STATISTISCHE DATENANALYSE DER /N-W VO-LNFEKTIONSVERSUCHE
......................................
69
3.3 DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
................................
70
3.3.1 ETABLIERUNG DER DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
...........................
70
3.3.1.1 BESCHICHTUNG DER
DECKGLAESCHEN.........................................................................
70
3.3.1.2
KULTURBEDINGUNGEN...............................................................................................
71
3.3.1.3. PRAEPARATION DER
DISSOZIATIONSKULTUR...................................................................71
3.3.2 CHARAKTERISIERUNG DER
DISSOZIATIONSKULTUR.................................................................73
3.3.2.1 REAKTIONSBEDINGUNGEN DER
IMMUNFLUORESZENZ..................................................73
3.3.2.2 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ ZUR DARSTELLUNG DER OLFAKTORISCHEN
NEURONE
.....
74
3.3.2.3 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ ZUR DARSTELLUNG NICHT-NEURONALER
ZELLEN
..............
75
3.3.2.4 QUANTIFIZIERUNG AUSGEWAEHLTER ZELLULAERER
KOMPONENTEN...................................76
3.3.2.5
AUSWERTUNG..........................................................................................................
76
3.3.4 BDV-INFEKTION DER
DISSOZIATIONSKULTUR....................................................................76
3.3.4.1
BDV-INFEKTION.......................................................................................................
76
3.3.4.2 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ (IF) ZUM NACHWEIS VON BDV-N
..........................
77
3.3.4.3 AUSWERTUNG DER
BDV-INFEKTION............................................................................
77
3.3.4.4 DOPPELMARKIERUNG ZUM NACHWEIS VON SS ILL-TUBULIN UND BDV-N
....................
77
3.4 ORGANOTYPISCHEN GEWEBEKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
....
78
3.4.1 ETABLIERUNG DER ORGANOTYPISCHEN GEWEBEKULTUR
.......................................................
78
3.4.1.1
KULTURBEDINGUNGEN...............................................................................................
76
3.4.1.2
PRAEPARATION...........................................................................................................79
3.4.2 BDV-INFEKTION DER ORGANOTYPISCHEN
GEWEBEKULTUR...................................................79
3.4.2.1
INFEKTION................................................................................................................79
3.4.2.2. IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON
BDV-N.....................................................79
3.4.2.3
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG ZUM NACHWEIS VIRALER RNA
............................................
80
3.5 CO-KULTUR AUS OLFAKTORISCHEM EPITHEL UND OLFAKTORISCHEN
HUELLZELLEN..........................................................................................................................
80
3.5.1 KULTURBEDINGUNGEN DER OECS
....................................................................................
80
3.5.1.1 BESCHICHTUNG DER
ZELLKULTURFLASCHEN...................................................................60
3.5.2 BDV-INFEKTION DER
OECS.............................................................................................81
3.5.2.1
BDV-INFEKTION.......................................................................................................
61
3.5.2.2 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ ZUM NACHWEIS VON
BDV-N.................................61
3.5.2.3
AUSWERTUNG..........................................................................................................
61
3.5.3 CO-KULTUR AUS OLFAKTORISCHEM EPITHEL UND
OECS...................................................... 81
3.5.3.1
KULTURBEDINGUNGEN...............................................................................................82
3.5.3.2 PRAEPARATION DER
CO-KULTUR...................................................................................
82
3.5.3.3 BDV-INFEKTION DER
CO-KULTUR...............................................................................
83
3.5.4 NACHWEIS VON VIRALER RNA MITTELS QUANTITATIVER REAL TIME RT-PCR
(QPCR)
.........
83
3.5.4.1
RNA-ISOLIERUNG.....................................................................................................
83
3.5.4.2
RT-REAKTION.........................................................................................................
85
3.5.4.3 QUANTITATIVE
REAL TIME POLYMERASE KETTENREAKTION
(QPCR)...............................66
4.
ERGEBNISSE......................................................................................................................92
4.1 CHARAKTERISIERUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS DES PFERDES
..
92
4.1.1 LOKALISATION DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS IN DER PFERDENASE
....................................
92
4.1.1.1 QUANTITATIVE AUSWERTUNG DES ANTEILS DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
...................
93
4.1.2 VERTEILUNG DER VERSCHIEDENEN TYPEN DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS...........................96
4.1.2.1 QUANTITATIVE AUSWERTUNG DES ANTEILS DER VERSCHIEDENEN
EPITHELTYPEN
............
97
4.1.3 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS UND
STATISTISCHE
AUSWERTUNG.........................................................................................................................
104
4.1.3.1 OLFACTORY MARKER PROTEIN
(OMP)........................................................................104
4.1.3.2 DOUBLECORTIN
(DCX)............................................................................................106
4.1.3.3 PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)
........................................................
110
4.1.3.4 TYROSINKINASE-REZEPTOR-A
(TRKA).....................................................................111
4.1.4 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER VERSCHIEDENEN TYPEN DES
OLFAKTORISCHEN
EPITHELS.......................................................................................................
114
LLL
4.1.4.1 UEBERGREIFENDE STATISTISCHE
AUSWERTUNG...........................................................115
4.1.4.2 WEITERE IMMUNHISTOLOGISCHE MARKER
........................................................
116
4.1.5 VERGLEICHENDE IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS
DER
RATTE...............................................................................................................................118
4.2 EXPERIMENTELLE INTRANASALE BDV-INFEKTION VON LEWIS-RATTEN
........
119
4.2.1
KLINIK...........................................................................................................................
119
4.2.2 HISTOPATHOLOGISCHE
BEFUNDE.....................................................................................
120
4.2.3 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON
BDV-N............................................................120
4.2.3.1 KINETIK DES NACHWEISES VON BDV-N IN DER NASE
...........................................
121
4.2.3.2 NACHWEIS VON BDV-N IM GEHIRN
.......................................................................
123
4.2.3.3 NEGATIVKONTROLLEN DER
IMMUNHISTOLOGIE.............................................................124
4.2.4 NACHWEIS VON BDV-N MRNA UND GENOMISCHER RNA MITTELS
IN-SITU-
HYBRIDISIERUNG..........................................................................................................
124
4.2.4.1 REAKTIONSMUSTER DER IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
.....................................................
125
4.2.4.2 KINETIK DES NACHWEISES VON BDV-N MRNA UND VIRALER GENOMISCHER
RNA
IM OLFAKTORISCHEN
EPITHEL.................................................................................................125
4.2.4.3 NACHWEIS VON VIRALER GENOMISCHER RNA UND BDV-N MRNA IM GEHIRN
......
130
4.2.4.4 NEGATIVKONTROLLEN DER IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
....................................................
131
4.2.5 UEBERGREIFENDE STATISTISCHE AUSWERTUNG DER
/N-WVO-LNFEKTIONSVERSUCHE
...............
132
4.2.6 NACHWEIS VON PROLIFERATIONSMARKERN IM OLFAKTORISCHEN EPITHEL
.............................
133
4.2.6.1
REAKTIONSMUSTER.................................................................................................134
4.2.6.2 GEGENUEBERSTELLUNG DER PROLIFERATIONSRATE IN BDV- UND
MOCK-INFIZIERTEN
TIEREN....................................................................................................134
4.3 DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
..............................
136
4.3.1 CHARAKTERISIERUNG DER
DISSOZIATIONSKULTUR...............................................................136
4.3.1.1 ZELLMORPHOLOGIE IN DER NATIVEN
KULTUR...............................................................136
4.3.1.2 REAKTIONSMUSTER DER OLFAKTORISCHEN NEURONE
..................................................
137
4.3.1.3 REAKTIONSMUSTER NICHT-NEURONALER
ZELLEN.........................................................138
4.3.1.4 QUANTIFIZIERUNG AUSGEWAEHLTER ZELLULAERER KOMPONENTEN
..................................
139
4.3.2 BDV-INFEKTION DER
DISSOZIATIONSKULTUR.....................................................................
140
4.3.2.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ ZUM NACHWEIS VON BDV-N
................................
140
4.3.2.2 NACHWEIS BDV-INFIZIERTER OLFAKTORISCHER
NEURONE............................................142
4.4 ORGANOTYPISCHE GEWEBEKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
....
143
4.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER ORGANOTYPISCHEN
GEWEBEKULTUR..........................................143
4.4.2 BDV-INFEKTION DER ORGANOTYPISCHEN GEWEBEKULTUR
.................................................
144
4.4.2.1 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON BDV-N
....................................................
144
4.4.2.2 NACHWEIS VON VIRALER GENOMISCHER RNA UND BDV-N MRNA MITTELS
IN-SITU-
HYBRIDISIERUNG..................................................................................................................145
4.5 CO-KULTUR AUS OLFAKTORISCHEM EPITHEL UND OLFAKTORISCHEN
........
146
HUELLZELLEN.........................................................................................................................
146
4.5.1 BDV-INFEKTION DER OLFAKTORISCHEN
HUELLZELLEN............................................................146
4.5.2 BDV-INFEKTION DER CO-KULTUR DER OLFAKTORISCHEN HUELLZELLEN UND DER
DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS................................................................147
4.5.2.1 ZUSAMMENFASSUNG DER REAKTIONSBEDINGUNGEN DER QUANTITATIVEN REAL
TIME RT-
PCR
(QPCR)....................................................................................................................147
4.5.2.3 NACHWEIS VIRALER GENOMISCHER UND BDV-N MRNA MITTELS
QUANTITATIVER
REAL TIME
RT-PCR............................................................................................................148
4.5.2.4 ZUSAMMENFASSENDER
VERGLEICH........................................................................
152
5.
DISKUSSION........................................................................................................................
154
5.1 CHARAKTERISIERUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS DES PFERDES .... 154
5.1.1 LOKALISATION DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS IN DER PFERDENASE
...................................
154
5.1.2 VERTEILUNG DER TYPEN DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS DES PFERDES
..............................
156
5.1.3 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS DES
PFERDES
....
158
5.1.4 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER TYPEN DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS
.......
162
5.1.5 SPEZIESUEBERGREIFENDE
BETRACHTUNG.........................................................................
164
5.2 INITIALE PHASE DER INFEKTION NACH INTRANASALER BDV-INFEKTION VON
LEWIS-RATTEN....................................................................................................................
167
5.2.1 KLINIK UND
HISTOPATHOLOGIE........................................................................................167
5.2.2 NACHWEIS VON
BDV-N...............................................................................................
168
5.2.3 NACHWEIS VON VIRALER GENOMISCHER RNA UND BDV-N MRNA
................................
170
5.2.4 KORRELATION DES NACHWEISES VON BDV-N, KORRESPONDIERENDER MRNA UND
GENOMISCHER RN
A..............................................................................................................172
5.2.5 PROLIFERATION DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS..................................................................175
5.3 DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
..............................
175
5.3.1 CHARAKTERISIERUNG DER
DISSOZIATIONSKULTUR...............................................................175
5.3.2 BDV-INFEKTION DER DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS.......................178
5.4 ORGANOTYPISCHE GEWEBEKULTUR DES OLFAKTORISCHEN EPITHELS
....
179
5.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER ORGANOTYPISCHEN
GEWEBEKULTUR..........................................179
5.4.2 BDV-INFEKTION DER ORGANOTYPISCHEN
GEWEBEKULTUR.................................................180
5.5 CO-KULTUR AUS OLFAKTORISCHEM EPITHEL UND OLFAKTORISCHEN
HUELLZELLEN........................................................................................................................
180
5.5.1 NACHWEIS VON
BDV-N...............................................................................................180
5.5.2 QUANTIFIZIERUNG VON
BDV-RNA................................................................................
182
5.6
SCHLUSSBETRACHTUNG............................................................................................184
6. ZUSAMMENFASSUNG /
SUMMARY.................................................................................
187
6.1
ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................................
187
6.2
SUMMARY.......................................................................................................................
190
7.
LITERATURVERZEICHNIS.................................................................................................194
8.
ANHANG...............................................................................................................................
226
8.1 LOESUNGEN UND
PUFFER............................................................................................226
8.1.1
HISTOLOGIE...................................................................................................................226
8.1.2 IMMUNHISTOLOGIE UND IMMUNFLUORESZENZ
................................................................
226
8.1.3 SONDENHERSTELLUNG UND
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG........................................................
227
8.2
BEZUGSQUELLEN.........................................................................................................
231
8.3
TABELLEN.......................................................................................................................235
8.3.1 CHARAKTERISIERUNG DES OLFAKTORISCHEN EPITHEL DES PFERDES
....................................
235
8.3.2 EXPERIMENELLE INTRANASALE INFEKTION VON LEWIS-RATTEN
..........................................
242
8.3.3 DISSOZIATIONSKULTUR DES OLFAKTORISCHEN
EPITHELS......................................................251
8.3.4. CO-KULTUR AUS OLFAKTORISCHEM EPITHEL UND OLFAKTORISCHEN
HUELLZELLEN
....................
252
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