Hepatische Arzneistofftransporter der Oatp1b-Subfamilie von Haus- und Nutztieren:: Klonierung, Polymorphismenanalyse und funktionelle Charakterisierung
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2017
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
Abbildungsverzeichnis I
Tabellenverzeichnis II
Abkürzungen Ill
1 Literaturübersicht 1
1 1 Die Leber 1
111 Anatomie und Histologie 1
112 Transportsysteme an Hepatozyten 2
1 2 Die Familie der SLCO-Transporter 6
1 3 Die humanen Lebertransporter OATP1B1 und OATP1B3 10
131 Vorkommen und Struktur 10
132 Funktion und Substratspektrum 11
133 Polymorphismen und ihre funktionellen Auswirkungen 12
1 4 Die Oatplb-Subfamilie in der Leber verschiedener Tierarten 16
I15 Der canine Oatplb4 18
I16 Zielsetzung der Arbeit 20
I
| 2 Material 22
121 Polymerase-Ketten-Reaktion 22
I211 Eingesetzte Primer 22
I212 Enzyme 23
|22 Vektoren 25
i;
1221 pcDNA5/FRT/VS-His-TOPO Vektor 25
|222 pOG44 Vektor 25
|23 Bakterienstämme 26
I24 Quantitative Real-Time PCR 26
|241 TaqMan Gene Expression Assays 26
|242 TaqMan Universal PCR 26
j25 Längenstandards 27
f
S26 Kommerziell erhältliche Kits und Materialien für die Molekularbiologie 27
INHALTSVERZEICHNIS
2 7 Puffer und Medien 27
2 8 Native Geielektrophorese 28
2 9 Zellkultur 28
291 Zelllinien 28
292 Medien 29
293 Antibiotika 30
294 Stabile und transiente Transfektion 30
2 10 Transportmessungen an eukaryotischen Zellen 31
2 10 1 Puffer und Lösungen 31
2 11 Proteinbestimung 31
2 12 Xenopus laevis Oozyten 32
2 12 1 Versuchstiere 32
2 12 2 Puffer und Lösungen 32
2 13 Immunfluoreszenz 33
2 13 1 Puffer und Medien 33
2 14 Proteinanalyse 34
2 14 1 Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 34
2 14 2 Puffer und Lösungen für Western Blot 34
2 14 3 Filmentwicklung 35
2 14 4 Längenstandards 35
2 14 5 Kommerziell erhältliche Kits und Materialien für die Proteinanalyse 36
2 15 Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe 36
2 16 Chemische Substanzen 37
2 16 1 Reagenzien 37
2 16 2 Feinchemikalien 39
2 17 Radioaktiv-markierte Substanzen 39
2 18 Geräte 40
2 19 Verbrauchsmaterial 42
2 20 Bioinformatische Programme und Datenbanken
43
INHALTSVERZEICHNIS
3 Methoden 45
3 1 Allgemeine molekularbiologische Methoden 45
311 Native Agarose-Gelelektrophorese 45
312 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel 45
313 Aufreinigen von Plasmid-DNA im Mini-Maßstab 46
314 Aufreinigung von Plasmid-DNA im Midi-Maßstab 46
315 Konzentrationsbestimmung DNA 47
316 Konzentrationsbestimmung RNA 47
3 2 Methoden zur Isolierung und Aufarbeitung von RNA 48
321 Probenmaterial 48
322 RNA Isolation aus Gewebe 51
323 RNA Isolation aus Zellen 51
324 DNase-Verdau 52
325 RNA-Aufreinigung 52
326 RNA-Quantifizierung mittels Agilent 2100 Bioanalyzer 53
327 cDNA-Synthese aus Gesamt-RNA 54
3 3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 55
331 Allgemeine Regeln zur Primerauswahl 55
332 PCR-Reaktionsansatz 56
333 Touchdown-PCR 57
334 Nested-PCR Oatplb4 des Hundes 58
335 Kolonie-PCR 58
336 PCR zur Generierung von 3 -A-Überhängen 59
337 Zielgerichtete Mutagenese 59
338 Quantitative Real-Time PCR 61
3 4 DNA-Klonierung 63
341 TOPO-Klonierung 63
3 5 Transformation 63
3 6 Sequenzierung und Auswertung von Sequenzspuren 64
3 7 Kultivierung eukaryotischer Zellen 64
371 Passagieren der Zellen 65
372 Aussähen der Zellen 65
INHALTSVERZEICHNIS
373 Kryokonservierung der Zellen 65
374 Auftauen der Zellen 65
3 8 Transfektion eukaryotischer Zellen 66
381 Transiente Transfektion 66
382 Stabile Transfektion 66
3 9 Transportmessung an eukaryotischen Zellen 67
391 Ansetzen der Messlösungen und Vorbereitung der Zellen 68
392 Aufnahmeversuch 68
393 Flüssigkeitsszintillationsmessung 68
394 Proteinbestimmung 69
395 Auswertung der Aufnahmeversuche 69
3 10 Xenopus laevis Oozyten 69
3 10 1 cRNA-Synthese 70
3 10 2 Gewinnung der Xenopus laevis Oozyten 72
3 10 3 Mikroinjektion der cRNA 72
3 10 4 Transportmessungen an Oozyten 73
3 11 Immunfluoreszenz 74
3 11 1 Indirekte Immunfluoreszenz mit dem Maus anti-V5-Antikörper 74
3 11 2 Mikroskopie 76
3 12 Western Blot 76
3 12 1 Proteinextraktion mit RIPA-Puffer 76
3 12 2 Proteinextraktion mit Proteo Extract Native Membrane Protein Extraction Kit
77
3 12 3 Proteinbestimmung mittels BCA Protein Assay Kit 77
3 12 4 Gellauf und Blotting 78
3 12 5 Blockierung der Membran und Antikörperreaktion 79
3 12 6 Detektion 79
4 Ergebnisse 81
4 1 Der canine Oatplb4-Transporter 81
411 Polymorphismen im cfOatplb4-Transporter 81
412 Expressionsunterschiede des caninen Oatplb4-Transporters in der Leber 86
413 Funktionelle Charakterisierung des caninen Oatplb4 im Zellkulturmodell 89
IV
414 Etablierung der stabil transfizierten cfOatplb4-WT-, cfOatplb4*- und
rOatplb2-Zelllinien 92
415 Funktionelle Charakterisierung der stabil transfizierten Zelllinien 93
416 Nachweis des caninen Oatplb4-Proteins 94
417 Heterologe Expression in Xenopus laevis Oozyten 98
4 2 Die Oatplb-Subfamilie anderer Tierarten 100
421 Sequenzanalyse der Oatplb-Subfamilie bei verschiedenen Tierarten 100
422 Funktionelle Charakterisierung der Oatplb-Transporter verschiedener
Tierarten 101
423 Nachweis der Oatplb-Proteine mit dem Maus anti-V5 Antikörper 102
4 3 Funktionelle Charakterisierung des bovinen Oatplb4 105
431 Substrataufnahme vergleichend zu OATP1B1 und OATP1B3 105
432 Zeitabhängigkeit 106
433 Kinetik der btOatplb4-vermittelten Aufnahme 107
5 Diskussion 109
5 1 Phylogenetische Verwandtschaftsverhältnisse der OATPIB-Mitglieder 109
5 2 Der canine Oatplb4-Transporter 112
521 Screening der Hundeproben auf Polymorphismen im Oatplb4-Transporter 112
522 Expression des caninen Oatplb4 114
523 Funktionelle Charakterisierung der cfOatplb4-Varianten 116
5 3 Der bovine Oatplb4-Transporter 123
5 4 Die Oatplb-Transporter weiterer Tierarten 124
6 Zusammenfassung 127
7 Summary 129
8 Literaturverzeichnis 130
9 Anhang 144
10 Danksagungen 148
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