Klonierung zweier Rattensertolizelllinien mit stabiler Expression eines humanen Androgenrezeptors unterschiedlicher CAG-Repeat-Länge als in vitro Modell zur Untersuchung testosteronabhängiger, mit der Spermatogenese assoziierter Gene.:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2017
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| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 124 Seiten 21 cm x 14.6 cm, 200 g |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis V
Abbildungsverzeichnis VI
Tabellenverzeichnis VIII
1 Einleitung und Ziele i
2 Literaturübersicht 4
2 1 Entwicklung und Histologie des Hodens 4
2 2 Zellpopulationen des Hodens 5
221 Sertolizellen 5
222 Keimzellen 6
223 Peritubuläre Myoidzellen 7
224 Leydig-Zellen 7
2 3 Spermatogenese 8
231 Ablauf der Spermatogenese 8
232 Spermiogenese 8
233 Kinetik der Spermatogenese 10
234 Störungen der Spermatogenese 12
235 Regulation der Spermatogenese 13
2 4 Regulation der Genexpression über Transkriptionsfaktoren 14
2 5 Der Androgenrezeptor (AR) 14
2 6 Das CAG-Repeat 18
2 7 Androgenabhängige Gene 20
2 8 Zellkultur 22
3 Material und Methoden 25
3 1 Klonierung humaner AR (CAG 18) 27
311 PCR humaner AR-Klon 27
312 Agarosegelelektrophorese 28
3121 Detektion 29
313 TA-Klonierung des humanen AR
29
II
314 DNA Mini-Präparation humane AR-Klone 32
315 Kontrollverdau mit Restriktionsendonukleasen 33
316 Sequenzierung 35
3 2 Klonierung humaner AR CAG14 und AR CAG36 36
321 Sequenzierung 36
322 Restriktionsdoppelverdau 36
323 Extraktion der AR cDNAs aus Agarosegel 37
324 Ligation 38
325 DNA Mini-Präparation 39
326 Kontrollverdau 39
327 Sequenzierung 39
3 3 Auswahl geeigneter Zelllinien für die Transfektion 40
331 RNA Isolierung aus Sertoli-Zelllinien 40
332 Aufreinigung der RNA 41
333 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 41
334 Amplifikation eines AR in Sertoli-Zelllinien 42
3341 Agarosegelelektrophorese und Detektion 43
3 4 Transfektion hAR CAG 18 und CAG 36 44
341 Zellkulturbedingungen 93RS2 Zellen 44
342 Selektionsvorversuch 44
343 Transformation der AR-Klone 45
344 DNA-Midi Präparation 45
345 Transfektion 47
346 optische Kontrolle des Transfektionserfolgs 48
347 Antibiotikaselektion 48
3 5 Charakterisierung der transfizierten Zelllinien 49
351 Immunfluoreszenz hAR 49
352 RNA-Isolation aus transfizierten Zellen 50
353 RNA Aufreinigung 50
354 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 50
355 Amplifikation hAR 50
Ill
3551 Agarosegelelektrophorese und Detektion 51
356 Western Blot 51
3 6 Stimulationsversuche 93RShAR18 und 93RShAR36 56
361 Testosteronstimulation 56
362 Zeitreihe Testosteronstimulation 56
363 Bestimmung der CAG-Repeat-Länge (PAGE-PCR) 57
3631 Polyacrylamidgel 58
3632 Polyacrylamidgelelektrophorese und Detektion 58
364 Ermittlung der Housekeeper für RT-PCR 59
3641 Agarosegelelektrophorese und Detektion 60
3 7 Genexpressionsvergleich testosteronstimulierte Sertoli-Zelllinien 60
371 RNA-Isolation aus testosteronstimulierten Sertoli-Zelllinien 60
372 Aufreinigung der RNA 60
373 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 60
374 Real-time quantitative PCR 60
3741 Agarosegelelektrophorese und Detektion 62
375 Clusterin-ELISA (Enzym-Iinked Immunosorbant Assay) 63
3751 Testosteronstimulation 48 h für ELISA 63
3752 Probenvorbereitung für ELISA 64
3753 ELISA 64
3 8 Statistik 65
4 Ergebnisse 67
4 1 Generierung humaner AR-Klone mit unterschiedlicher CAG-Repeat Länge 67
4 2 Auswahl einer geeigneten Zelllinie für die Transfektion des hAR 70
4 3 Charakterisierung von zwei neuen hAR exprimierenden Ratten Sertoli Zelllinien 72
431 Immunfluoreszenz 73
432 Amplifikation des hAR in den transfizierten Zelllinien 74
433 Western Blot 75
434 Zeitreihe Testosteronstimulation
76
IV
435 Bestimmung der CAG-Repeat-Länge (PAGE-PCR) 76
436 Housekeeper-Platte 77
4 4 Genexpressionsvergleich testosteronsimulierte Zelllinien 78
441 Expression von AR und Clusterin ohne Testosteronstimulation 78
442 Expressionsvergleich unter Testosteronstimulation 80
443 ELISA 85
5 Diskussion 87
6 Zusammenfassung 95
7 Summary 97
8 Literaturverzeichnis 99
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