Die Bedeutung der Aktin-bindenden Proteine ADF, n-Cofilin und CAP2 für die synaptische Aktin-Dynamik und Transmitterfreisetzung:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch und Buch Verlag
2017
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS............................................................................................................I
ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................................
IV
1
EINLEITUNG.......................................................................................................................1
1.1 ROLLE DES AKTIN-ZYTOSKELETTS FUER STRUKTUR UND FUNKTION DER SYNAPSE
..................
1
1.1.1 AKTIN IN DER PRAESYNAPTISCHEN ENDIGUNG
..........................................................
1
1.1.2 AKTIN IN DER POSTSYNAPSE
.................................................................................
3
1.1.3 AKTIN UND SYNAPTISCHE
PLASTIZITAET.....................................................................5
1.2 DER AKTIN-TRETMUEHLENMECHANISMUS UND SEINE MODULATION
...........
.
.....................
6
1.3 REGULATORISCHE PROTEINE DER AKTIN-DYNAMIK UND IHRE FUNKTION IN DER
SYNAPSE..................................................................................................................
9
1.3.1 PROTEINE DER
ADF/COFILIN-FAMILIE.....................................................................9
1.3.2 FAMILIE DER CYCLASE-ASSOZIIERTEN PROTEINE (CAP)
.......................................
10
1.4 ZIELSETZUNG DER
ARBEIT...........................................................................................
12
2 MATERIAL UND
METHODEN.............................................................................................
14
2.1
CHEMIKALIEN...........................................................................................................
14
2.2 PRIMAERE
ANTIKOERPER.................................................................................................16
2.3 SEKUNDAERE
ANTIKOERPER...........................................................................................
17
2.4
FLUORESZENZFARBSTOFFE...........................................................................................
18
2.5 PUFFER UND
LOESUNGEN.............................................................................................
19
2.5.1 SDS-PAGE UND WESTERN B
LOT.......................................................................
19
2.5.2 CO-IMMUNPRAEZIPITATION
..................................................................................
20
2.5.3 PRAEPARATIVE METHODEN
...................................................................................
20
2.5.4 PUFFER FUER IMMUNHISTOCHEMIE UND IMMUNZYTOCHEMIE
.................................
22
2.5.5 MEDIEN UND PUFFER FUER PRIMAERE
ZELLKULTUR......................................................23
2.6
VERSUCHSTIERE.........................................................................................................24
2.7
HISTOLOGIE...............................................................................................................
26
2.7.1 TRANSKARDIALE PERFUSION VON
MAEUSEN........................................................... 26
2.7.2 ANFERTIGUNG VON
HIRNSCHNITTEN.......................................................................26
2.7.3
X-GAL-FAERBUNG...............................................................................................
27
2.7.4
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG.............................................................................
28
2.8 PRIMAERE HIPPOCAMPALE KULTUREN DER MAUS
2.6.1 VORBEREITUNG DER
DECKGLAESER.........................................................................
28
2.6.2 PRAEPARATION DER HIPPOCAMPALEN
NEURONE.....................................................29
2.8.3 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG PRIMAERER HIPPOCAMPALER KULTUREN
............
30
2.9
MIKROSKOPIE.............................................................................................................31
2.9.1 HELLFELD- UND
EPIFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE....................................................
31
2.9.2 KONFOKALE
LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE.......................................................
32
2.9.3 BEARBEITUNG UND AUSWERTUNG DER KONFOKALEN AUFNAHMEN
.........................
33
2.10 PRAEPARATIVE
METHODEN.........................................................................................
33
2.10.1 SUBZELLULAERE FRAKTIONIERUNG NACH
GUILLEMIN...............................................33
2.10.2 ISOLIERUNG VON
SYNAPTOSOMEN.....................................................................
35
2.10.3 SUBSYNAPTISCHE FRAKTIONIERUNG NACH
PHILLIPS.............................................39
2.11 BIOCHEMISCHE
METHODEN.....................................................................................
40
2.11.1 ARBEITEN MIT
PROTEINEN..................................................................................40
2.11.2 QUANTIFIZIERUNG VON
PROTEINEN.....................................................................40
2.11.3 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN
.........................................
40
2.11.4 ANALYSE DES F-/G-AKTIN-VERHAELTNISSES IN SYNAPTOSOMEN
.........................
42
2.11.5 BEHANDLUNG VON SYNAPTOSOMEN MIT AKTIN-MODIFIZIERENDEN TOXINEN
......
43
2.11.6 BESTIMMUNG DES V-SNARE/T-SNARE-VERHAELTNISSES IN SYNAPTOSOMEN...44
2.12 PHYSIOLOGISCHE
METHODEN...................................................................................46
2.12.1 ANALYSE DER GLUTAMATFREISETZUNG AUS SYNAPTOSOMEN
..............................
46
2.12.2 BESTIMMUNG DER GROESSE DES
RRP................................................................50
2.13 AUSWERTUNG UND
STATISTIK....................................................................................51
3
ERGEBNISSE................................................................................................................
52
3.1 ZELLULAERE UND SYNAPTISCHE EXPRESSION VON
ADF..................................................52
3.2 ERHOEHTE N-COFILIN-EXPRESSION IN SYNAPTISCHEN STRUKTUREN VON
ADFV*-TIEREN....55
3.3 ANALYSE DER
CAMKIIA-CRE-EXPRESSION.................................................................57
3.4 BEDEUTUNG DER DELETION VON ADF & N-COFILIN FUER DIE ZELLULAERE UND
SYNAPTISCHE
AKTIN-EXPRESSION..............................................................................63
3.5 BEDEUTUNG DER DELETION VON ADF & N-COFILIN FUER DIE SYNAPTISCHE
AKTIN-DYNAMIK.......................................................................................................
64
3.5.1 GESTOERTE DEPOLARISATIONSINDUZIERTE AKTIN-DYNAMIK DURCH DELETION
VON ADF & N-COFILIN
...............................................
65
3.5.2 REDUZIERTE INTRINSISCHE AKTIN-DYNAMIK IN ACC-SYNAPTOSOMEN
..................
69
3.6 BEDEUTUNG DER DELETION VON ADF & N-COFILIN FUER DIE EXPRESSION
WICHTIGER
SYNAPTISCHER
PROTEINE..........................................................................................
73
3.7 BEDEUTUNG DER DELETION VON ADF & N-COFILIN FUER DIE RATE GEDOCKTER
VESIKEL
IN
ACC-MUTANTEN.................................................................................................
75
3.6 BEDEUTUNG DER DELETION VON ADF & N-COFILIN FUER DIE SYNAPTOSOMALE
GLUTAMATFREISETZUNG.............................................................................................
76
3.8.1 EXTRASYNAPTOSOMALES GLUTAMAT UND SPONTANE GLUTAMATFREISETZUNG
.........
76
3.8.2 CA2+-ABHAENGIGE GLUTAMATFREISETZUNG NACH DEPOLARISATION
........................
76
3.6.3 ERHOEHTER GESAMT-GLUTAMATGEHALT IN ACC-SYNAPTOSOMEN
.........................
80
3.8.4 ROLLE DER VESIKEL-POOLS BEI DER UNTERSCHIEDLICHEN
GLUTAMATFREISETZUNG
IN WT- UND
ACC-SYNAPTOSOMEN..................................................................62
3.9 NEURONALE EXPRESSION DES AKTIN-BINDENDEN PROTEINS CAP2
.............................
84
4
DISKUSSION..................................................................................................................
88
4.1 SYNAPTISCHE EXPRESSION UND BEDEUTUNG VON ADF FUER DIE ZELLULAERE UND
SYNAPTISCHE
AKTIN-EXPRESSION.............................................................................
69
4.2 UNTERSUCHUNG DES DELETIONSMUSTERS VON N-COFILIN IN DER
NCOFLX/LX,CAMKII*CRE-
MAUS UND IMPLIKATIONEN FUER DIE HYPERAKTIVITAET DER ACC-MAUS
.........................
90
4.3 ROLLE VON ADF UND N-COFILIN FUER DIE ZELLULAERE UND SYNAPTISCHE
AKTIN-DYNAMIK.......................................................................................................92
4.4 ROLLE VON ADF UND N-COFILIN FUER DIE SYNAPTISCHE TRANSMITTER-
FREISETZUNG
......
95
4.5 DIE NEURONALE EXPRESSION UND FUNKTION VON CAP2
.........................................
101
5 LITERATUR
...............................................................
105
ABBILDUNGSVERZEICHNIS..............................................................................................
122
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
............................................
123
LEBENSLAUF....................................................................................................................125
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Inhaltsverzeichnis