Autodisplay eines vollständigen IgG-Antikörpers:
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| Published: |
Münster
2015
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|---|---|
| adam_text | INHALT
ZUSAMMENFASSUNG..........................................................................................................1
SUMMARY.........................................................................................................................
2
I.
EINLEITUNG..............................................................................................................3
1. ANTIKOERPER: AUFBAU, EINTEILUNG UND
FUNKTIONEN............................................................3
2. GEWINNUNG VON A
NTIKOERPERN............................................................................................
6
2.1.
TIER-SEREN.....................................................................................................................
6
2.2.
HYBRIDOMA-TECHNIK....................................................................................................
6
2.3. DISPLAY-TECHNOLOGIEN FUER ANTIKOERPER UND IHRE F RAGM ENTE
.................................
8
2.3.1.
PHAGEN-DISPLAY.......................................................................................................
8
2.3.2. ZELLULAERE
DISPLAY-TECHNOLOGIEN............................................................................10
3. PHARM AZEUTISCHE ANWENDUNGEN VON A NTIKOERPERN
.....................................................
12
4.
AUTODISPLAY........................................................................................................................
14
5. CARCINOEMBRYONALES ANTIGEN
(CEA)..............................................................................17
6. ZIEL DER
ARBEIT....................................................................................................................19
II. MATERIAL UND
METHODEN.....................................................................................
20
1. M
ATERIAL...............................................................................................................................
20
1.1. G
ERAETE..........................................................................................................................20
1.2. SOFTW
ARE.....................................................................................................................
22
1.3. CHEMIKALIEN UND V ERBRAUCHSM
ATERIALIEN.............................................................
22
1.4. LOESUNGEN UND
PUFFER................................................................................................
24
1.4.1. PUFFER UND LOESUNGEN FUER ARBEITEN MIT
BAKTERIEN................................................24
1.4.2. PUFFER UND LOESUNGEN FUER ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN
ZELLEN............................25
1.4.3. LOESUNGEN FUER DIE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE.......................................................25
1.4.4. LOESUNGEN FUER SDS-PAGE UND WESTERN BLOT
.........................................................
26
1.4.5. LOESUNGEN FUER DIE BEHANDLUNG MIT PROTEINASE K
..................................................
27
1.4.6. LOESUNGEN FUER DIE ISOLIERUNG VON PROTEINEN DER AEUSSEREN MEMBRAN
GRAM
NEGATIVER
BAKTERIEN..............................................................................................
27
1.4.7. LOESUNGEN FUER DIE BESTIMMUNG DES GESAMTPROTEINGEHALTS NACH LOWRY
.............
27
1.5. NAEHRMEDIEN FUER ARBEITEN M IT B
AKTERIEN...............................................................26
1.6. MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR,
28
1.7. REAGENZIENSAETZE
(*KITS )...........................................................................................29
1.8. E NZYM
E........................................................................................................................29
1.9. A
NTIKOERPER...................................................................................................................29
1.10.
OLIGONUKLEOTIDE......................................................................................................
30
1.11. B AKTERIENSTAEM M
E...................................................................................................30
1.12.
ZELLLINIEN..................................................................................................................31
1.13.
PLASMIDE...................................................................................................................32
2. M
ETHODEN...........................................................................................................................
33
2.1. ARBEITEN M IT N UKLEINSAEUREN
....................................................................................
33
2.1.1.
PLASMIDISOLIERUNG.................................................................................................
33
2.1.2.
PCR........................................................................................................................
33
2.1.3. SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN
......................................................
34
2.1.4.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE...................................................................................
34
2.1.5. FAERBEN VON
AGAROSEGELEN.....................................................................................
34
2.1.6. EXTRAKTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
...........................................
34
2.1.7.
LIGATION..................................................................................................................35
2.1.8.
DNA-SEQUENZANALYSE............................................................................................
35
2.2. ARBEITEN M IT
PROTEINEN.............................................................................................
35
2.2.1. ISOLIERUNG VON PROTEINEN DER AEUSSEREN MEMBRAN GRAM-NEGATIVER
BAKTERIEN
...
35
2.2.2. NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
................
36
2.2.3. WESTERN BLOT UND PROTEINDETEKTION AUF PVDF-MEMBRANEN
................................
37
2.2.4. BESTIMMUNG DES GESAMTPROTEINGEHALTES NACH LOWRY
........................................
38
2.2.5.
KO-IMMUNPRAEZIPITATION........................................................................................
38
2.3. ARBEITEN M IT ESCHERICHIA COLI (E. COLI)
....................................................................
39
2.3.1. KRYOKONSERVIERUNG UND STAMMLAGERUNG VON
E. COLI
...........................................
39
2.3.2. GEWINNUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN VON E.
COLI..............................................39
2.3.3. TRANSFORMATION VON
E. COLI MITTELS
ELEKTROPORATION............................................40
2.3.4. KULTIVIERUNG VON E.
COLI.........................................................................................
40
2.3.5. EXPRESSION DER AUTOTRANSPORTER-FUSIONSGENE IN E. COLI
.....................................
41
2.3.6. BEHANDLUNG VON E. COLI-ZELLEN MIT PROTEINASE K
..................................................
41
2.3.7. CROSSLINKING VON PROTEINEN AUF DER OBERFLAECHE GANZER
E. COLI-ZELLEN
...................
41
2.3.8. AUFNAHME VON WACHSTUMSKURVEN VON E. COLI
.....................................................
42
2.3.9. BINDUNG VON GEGEN DEN HUMANEN FC-TEIL GERICHTETEN ANTIKOERPERN AN
ANTIKOERPERKETTEN-PRAESENTIERENDE
E. COLI
.............................................................
42
2.3.10. BINDUNG VON CARCINOEMBRYONALEM ANTIGEN (CEA) AN
ANTIKOERPERKETTEN
PRAESENTIERENDE
E.
COLI...........................................................................................43
2.4. ARBEITEN M IT EUKARYOTISCHEN ZELLLINIEN
.................................................................
44
2.4.1. KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN
ZELLEN.............................................................. 44
2.4.2. PASSAGIEREN UND AUSSAEEN VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN
........................................
44
2.4.3. KRYOKONSERVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN
ZELLEN.................................................. 45
2.4.4. IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG VON
A431-ZELLEN................................................45
2.4.5. IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG VON
SW-403-ZELLEN...........................................46
2.4.6. FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE ANALYSE DES BINDUNGSVERMOEGENS VON SCFV-
PRAESENTIERENDEN COLI AN
A431-TUMORZELLEN....................................................47
2.4.7. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG DES BINDUNGSVERMOEGENS VON
ANTI-EGFR-SCFV PRAESENTIERENDEN
E. COLI AN A431-ZELLEN
....................................
48
2.4.8. GEWINNUNG EINES CEA-HALTIGEN EXTRAKTES AUS
SW-403-ZELLEN............................49
III. EXPERIMENTE UND
ERGEBNISSE............................................................................50
1. AUTODISPLAY EINES IGG-ANTIKOERPERS AUF
E. COLI..............................................................50
1.1. EXPRESSION DER EINZELNEN KETTEN DES ANTIKOERPERS T84.66 ALS A
UTOTRANSPORTER-
FUSIONSPROTEINE IN E.
COLI.........................................................................................
50
1.2. KOEXPRESSION DER SCHW EREN UND LEICHTEN KETTE VON T84.66 ALS
A UTOTRANSPORTER-FUSIONSPROTEINE IN E. COLI
..........................................................
59
1.3. OBERFLAECHENSTAENDIGKEIT DER ANTIKOERPERKETTEN AUF
E. COLI
..................................
62
1.4. Q UERVERNETZUNG DER ANTIKOERPERKETTEN AUF
E. COLI................................................65
1.5. KO-IMMUNPRAEZIPITATION DER ANTIKOERPERKETTEN
....................................................
68
1.6. HERSTELLUNG EINES CEA-HALTIGEN EXTRAKTES AUS TUM ORZELLEN
.............................
72
1.7. BINDUNG DES ANTIGENS CEA AN DEN AUF
E. COLI PRAESENTIERTEN A NTIKOERPER
..........
75
2. TUMORZELL-TARGETING MITTELS
AUTODISPLAY....................................................................
62
2.1. IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG VON
A431-ZELLEN................................................83
2.2. BINDUNG VON A NTIKOERPERFRAGM ENT-PRAESENTIERENDEN E. COLI AN T UM
ORZELLEN.. 84
IV.
DISKUSSION...........................................................................................................88
1. AUTODISPLAY EINES IGG-ANTIKOERPERS AUF
E. COLI
..............................................................
88
2. AUTODISPLAY EINES VOLLSTAENDIGEN ANTIKOERPERS: BEDEUTUNG UND
PERSPEKTIVEN
.......
93
3. TUMOR TARGETING MITTELS E.
COLI.......................................................................................
96
4.
FAZIT.....................................................................................................................................
99
V.
LITERATURVERZEICHNIS.........................................................................................100
VI.
ANHANG...............................................................................................................
113
1. A
BKUERZUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................
113
2.
SEQUENZEN........................................................................................................................
115
2.1. UET
84.66
(SCHWERE ANTIKOERPERKETTE VON T84.66) AUS PW W 003
.........................
115
2.2.
L
T S
4.66
(LEICHTE ANTIKOERPERKETTE VON 184.66) AUS PW W 004
............................
116
3. PLASM
IDKARTEN..................................................................................................................
117
4.
PUBLIKATIONEN...................................................................................................................
118
LEBENSLAUF.
121
|
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