Struktur und Funktion der Schilddrüsenhormontransporter MCT8 und MCT10:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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Berlin
2016
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG........................................................................................................
1
1.1
SCHILDDRUESENHORMONE................................................................................................................
1
1.2 MOLEKULARE MECHANISMEN DER SCHILDDRUESENHORMON-WIRKUNG
.............................................
3
1.3 PLASMATRANSPORT DURCH
TH-TRANSFERPROTEINE..........................................................................
4
1.4 METABOLISMUS VON SCHILDDRUESENHORMONEN
.............................................................................
5
1.5
SCHILDDRUESENHORMONTRANSPORTER...............................................................................................7
1.5.1 DIE MAJOR FACILITATOR SUPERFAMILIE
(MFS).................................................................................7
1.5.1.1 DER ROCKER-SWITCH
MECHANISMUS...............................................................................................9
1.5.1.3 SCHILDDRUESENHORMONTRANSPORTER DER MCT
FAMILIE.................................................................11
1.5.1.3.1 DER MONOCARBOXYLATTRANSPORTER 1 0
.........................................................................................11
1.5.1.3.2 DER MONOCARBOXYLATTRANSPORTER 8
...........................................................................................12
1.5.1.3.2.1 DAS ALLAN-HERNDON-DUDLEY SYNDROM............................
14
1.5.1.3.2.2 MAUSMODELLE DES MCT-VERMITTELTEN
TH-TRANSPORT...............................................................15
1.5.1.3.2.3 STRUKTURMODELL DES MONOCARBOXYLATTRANSPORTERS 8
................................................ 16
1.5.1.3.3 UNTERSCHIEDE BEI DER SUBSTRATSPEZIFITAET ZWISCHEN MCT8 UND
MCT10.................................18
1.5.1.3.4 INHIBITOREN DES MCT8-VERMITTELTEN SCHILDDRUESENHORMONTRANSPORT
....................................
19
1.6 ZIELSETZUNG DER
DISSERTATION....................................................................................................20
2 MATERIAL UND METHODEN
.......................................
23
2.1 M
ATERIAL.....................................................................................................................................
23
2.1.1
CHEMIKALIEN...............................................................................................................................23
2.1.2 VORGEFERTIGTE REAGENZSYSTEME
(KITS)......................................................................................
23
2.1.3
ENZYME.......................................................................................................................................
24
2.1.4
GERAETE........................................................................................................................................
25
2.1.5
VERBRAUCHSMATERIALIEN............................................................................................................
27
2.1.6
SOFTWARE.....................................................................................................................................
28
2.1.7
DATENBANKEN..............................................................................................................................28
2.1.8
ANTIKOERPER..................................................................................................................................29
2.2 METHODEN
.............................
29
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN............................................................................................
29
2.2.1.1 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE IN
MCT10......................................................................................
29
2.2.1.2 HITZESCHOCK-TRANSFORMATION IN KOMPETENTE DH5CT E. COLI-ZELLEN
.........................................
31
2.2.1.3 MINIPRAEP
...............................................
2.2.1.4 BESTIMMUNG DER
DNA-KONZENTRATION......................................................................................
32
2.2.1.5 RESTRIKTIONSANALYSE DES
MUTAGENESEPRODUKTS.......................................................................
33
2.2.1.6 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA
.............................................................................
33
2.2.1.7
SEQUENZIERUNG...........................................................................................................................
34
2.2.1.8
MIDIPRAEP.....................................................................................................................................
34
2.2.1.9 CRNA
SYNTHESE...........................................................................................................................
34
2.2.2
ZELLKULTUR.....................................................................................................................................
36
2.2.2.1 ALLGEMEINE
KULTURBEDINGUNGEN...............................................................................................
36
2 2.2.2 KULTIVIERUNG UND PASSAGIEREN VON MDCK-1
ZELLEN..................................................................37
2.2.2.3 BESTIMMUNG DER
ZELLZAHL..........................................................................................................
37
2.2.2.4 STABILE TRANSFEKTION VON MDCK-1 ZELLEN
................................................................................
37
2 2.2.5 ZELLERNTE UND
-LYSE.....................................................................................................................
38
Z.2.2.6 KRYOKONSERVIERUNG VON
ZELLEN..................................................................................................38
2.2.2.7
OBERFLAECHENBIOTINYLIERUNG........................................................................................................
39
2.2.2.5 AUSSAAT VON MDCK-1
ZELLEN.....................................................................................................
40
2.2.2.8.1 FUER RADIOAKTIVE UND LC/MS2-BASIERENDE
AUFNAHMEEXPERIMENTE.......................................40
2.2.2.8.2 FUER NICHT-RADIOAKTIVE
AUFNAHMEEXPERIMENTE........................................................................
40
2.2.2.9 XENOPUS
OOZYTEN.......................................................................................................................
40
2.2.2.9.1 TEST AUF
EXPRESSION....................................................................................................................41
2.2.3 TRANSPORTSTUDIEN MITTELS RADIOAKTIV-MARKIERTER SUBSTRATE
......................................
41
2.2.3.1 BERECHNUNG DER EINZUSETZENDEN
TRACERMENGE......................................................................
42
2.2.3.2 AUFREINIGUNG DES
125L-TRACERS...................................................................................................42
2.2.3 3 MESSUNG EINES
ZEITVERLAUFS......................................................................................................
43
2.2.3.3.1 IN MDCK-1
ZELLEN......................................................................................................................
43
2.2.3.3 2 IN XENOPUS
OOZYTEN..............................................................................................................
43
2.2.3.4 BESTIMMUNG VON
KM-WERTEN...................................................................................................44
2.2.3.5 EFFLUX RADIOAKTIV-MARKIERTER
JODTHYRONINE............................................................................
45
2.2.3.6 ICSO
BERECHNUNGEN.....................................................................................................................
45
2.2.4 LC/MS2-BASIERENDE
TRANSPORTSTUDIEN....................................................................................46
2.2.4.1 PROBENAUFBEREITUNG FUER DIE LC/MS2-MESSUNG
.........
.
.............................................................46
2.2.5 NICHT-RADIOAKTIVE
TRANSPORTSTUDIEN........................................................................................
47
2.2.5.1 MESSUNG EINES ZEITVERLAUFS
......................................................
47
2.2.5.2 ICSO
BERECHNUNGEN....................................................................................................................
48
2.2.5.3 STATISTIK ZUR VALIDIERUNG DES NICHT-RADIOAKTIVEN
AUFNAHMEASSAYS.......................................48
2.2.6 PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN.............................................................................................
49
2.2.6.1 BESTIMMUNG DER
PROTEINKONZENTRATION..................................................................................50
2.2.6.2 DISKONTINUIERLICHE
SDS-GELELEKTROPHORESE..............................................................................50
2.2.6.3 WESTERN
BLOT..............................................................................................................................
51
2.2.6.4
IMMUNODETEKTION......................................................................................................................
51
3
ERGEBNISSE....................................................................................................53
3.1 ZIELGERICHTETE AENDERUNG DES MCTIO-SUBSTRATSPEKTRUMS DURCH WENIGE
AMINOSAEURE-
AUSTAUSCHE................................................................................................................................
53
3.1.1 DAS SUBSTRATSPEKTRUM VON
MCT10.........................................................................................
53
3.1.2 AUSWAHL VON ZIEL-AMINOSAEUREN ANHAND DES MCT8-HOMOLOGIEMODELLS
.............................
53
3.1.3 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MCT10MCT8 CHIMAEREN
................................................
55
3.1.4 AUSWIRKUNGEN DER ZIELGERICHTETEN AMINOSAEUREAUSTAUSCHE AUF DEN
SUBSTRAT-EXPORT
.....
57
3.1.5 DAS SUBSTRATSPEKTRUM VON MCT10
MCTS
CHIMAEREN IM VERGLEICH ZU MCT10 UND MCT8......59
3.1.6 ZWEI PUNKTMUTATIONEN ERMOEGLICHEN DEN T
4
-TRANSPORT DURCH MCT10
...............................
61
3.1.7 EFFEKT DER GERICHTETEN MUTAGENESE AUF DEN TRANSPORT AROMATISCHER
AMINOSAEUREN.......63
3.2 ENTWICKLUNG EINES NEUARTIGEN, NICHT-RADIOAKTIVEN AUFNAHMEASSAYS
..................................
65
3.2.1 METHODENAUFBAU DER NICHT-RADIOAKTIVEN SUBSTRAT-DETEKTION IN
MCT8-MDCK-1 ZELLEN.. 65
3.2.2 VERGLEICH DURCH ICSO-BESTIMMUNG MIT DER RADIOAKTIVEN
METHODE......................................66
3.2.3 VALIDIERUNG DES NICHT-RADIOAKTIVEN AUFNAHMEASSAY
............................................................
67
3.3 SILYCHRISTIN, EIN FLAVONOL AUS DER MARIENDISTEL, IST EIN POTENTER
MCT8-LNHIBITOR
..............
69
3.3.1 IDENTIFIZIERUNG DES FLAVONOL-GEMISCHS SILYMARIN ALS MCT8-LNHIBITOR
................................
70
3.3.2 DAS FLAVONOID SILYCHRISTIN VERMITTELT DIE INHIBITORISCHE WIRKUNG
VON SY
...........................
71
3.3.3 BESTIMMUNG DES WIRKMECHANISMUS DER SC VERMITTELTEN
MCT8-LNHIBITION.......................73
3.3.4 EFFEKT VON SC AUF TS-EXPORT UND T RIM P O
RT............................................................................
74
3.3.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR SPEZIFITAET VON
SC....................................................................................76
3.3.6 EFFEKT VON SILYCHRISTIN AUF MCT10MCRE
CHIMAEREN...................................................................77
4
DISKUSSION....................................................................................................77
4.1 ZIELGERICHTETE AENDERUNG DES MCTIO-SUBSTRATSPEKTRUMS DURCH GEZIELTE
AMINOSAEURE-
AUSTAUSCHE
................................................................................................................................77
4.1.1 VORTEIL DER STRUKTURGELEITETEN MUTAGENESE ZUR FUNKTIONELLEN
CHARAKTERISIERUNG VON
MCT10........................................................................................................................................
77
4.1.2 LOKALISATION DER MCT10
MCTS
CHIMAEREN IN DER ZELLE
...............................................................
78
4.1.3 SUBSTRATSPEKTRUM DER MCT10MCR8
CHIMAEREN.........................................................................80
4.1.4 ALAL21 BESETZT EINE ENTSCHEIDENDE POSITION AM ENDE DES
SUBSTRATKANALS
.......................
82
4.1.5 THR207 KOENNTE EINEN EINFLUSS AUF DIE GROESSE DER
SUBSTRATBINDUNGSTASCHE AUSUEBEN.......83
4.1.6 TYRL84 IST ENTSCHEIDEND FUER DEN TRANSPORT AROMATISCHER AMINOSAEUREN
DURCH MCT10... 84
4.1.7 EINORDNUNG DER ERGEBNISSE IM VERGLEICH MIT WEITEREN MFS-PROTEINEN
.............................
84
4.1.8
FAZIT.............................................................................................................................................85
4.2 ENTWICKLUNG EINES NEUARTIGEN, NICHT-RADIOAKTIVEN AUFNAHMEASSAYS ZUR
SCHNELLEN ANALYSE
DER FUNKTION VON
SCHILDDRUESENHORMONTRANSPORTERN................................................
87
4.2.1 DER NICHT-RADIOAKTIVE AUFNAHMEASSAY IST EINFACH DURCHFUEHRBAR UND
VALIDE......................87
4.3 SILYCHRISTIN, EIN FLAVONOL EXTRAHIERT AUS DER MARIENDISTEL, IST EIN
POTENTER MCT8-
INHIBITOR........................................................................................................................
89
4.3.1 CHARAKTERISIERUNG DES MCT8-LNHIBITORS SILYCHRISTIN
..............................................................
89
4.3.2 EINORDNUNG DER MOEGLICHEN PHYSIOLOGISCHEN KONSEQUENZEN
...............................................
90
4.3.3 DER WIRKMECHANISMUS VON
SILYCHRISTIN..................................................................................92
5
ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................
...95
6
LITERATUR.........................................................................................................
97
7
ANHANG........................................................................................................
112
7.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS...........................................................................................................112
7.2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS............................................................................................................113
7.3
TABELLENVERZEICHNIS................................................................................................................
114
7.4
FORMELVERZEICHNIS...................................................................................................................114
|
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