Entwicklung und Charakterisierung von Gaussia princeps Luziferase-Antikörper-Fusionsproteinen: = Development and characterization of Gaussia princeps luciferase antibody fusion proteins
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| adam_text | ENTWICKLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
GAUSSIA PRINCEPS LUZIFERASE-ANTIKOERPER-FUSIONSPROTEINEN
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF GAUSSIO PRINCEPS
LUCIFERASE ANTIBODY FUSION PROTEINS
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
JULIANE KUMS
GEH. 13.08.1988 IN FREIBERG
WUERZBURG, 2017
INHALTSVERZEICHNIS
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG III
ZUSAMMENFASSUNG IV
SUMMARY VI
INHALTSVERZEICHNIS VIII
1. EINLEITUNG 1
1.1 ANTIKOERPER 1
1.1.1 STRUKTUR VON IGG-ANTIKOERPEM 1
1.1.2 ANTIKOERPER IN DER DIAGNOSTIK UND THERAPIE 4
1.1.3 CHARAKTERISIERUNG VON ANTIGEN-ANTIKOERPER-BINDUNGEN 7
1.1.4 ANTIKOERPER-INDUZIERTE SIGNALTRANSDUKTION 9
1.2 DAS TWEAK - FNL4 SYSTEM 16
1.2.1 STRUKTUR UND EXPRESSION VON TWEAK UND FNL4 16
1.2.2 FNL4-INDUZIERTE SIGNALWEGE 18
1.2.3 TWEAK UND FNL4 ALS THERAPEUTISCHE ZIELE 23
1.3 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 24
2. MATERIALIEN 25
2.1 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN UND ZELLKULTURMEDIEN 25
2.2 ENZYME 26
2.3 ANTIKOERPER 26
2.4 KOMMERZIELLE KITS 27
2.5 GERAETE, VERBRAUCHS- UND LABORMATERIAL 27
2.6 LOESUNGEN UND PUFFER 29
2.7 VERWENDETE ZELLLINIEN 31
2.8 PLASMIDE UND REKOMBINANTE FUSIONSPROTEINE 31
3. METHODEN 34
3.1 KLONIERUNG DER LEICHTEN ANTIKOERPERKETTEN FUER MURINE
18DL-FUSIONSPROTEINE 34
3.2 ZELLKULTUR 35
3.3 PRODUKTION UND REINIGUNG DER ANTIKOERPER-FUSIONSPROTEINE 35
3.3.1 PRODUKTION 35
3.3.2 ANTI-FLAG-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 36
3.4 WESTERN BLOT 36
3.4.1 SDS-PAGE 36
3.4.2 ELEKTROTRANSFER DER PROTEINE AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN 37
3.4.3 IMMUNDETEKTION 37
3.5 SILBERFAERBUNG 37
3.6 GELFILTRATION (GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE) 38
3.7 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 38
3.8 GAUSSIA PRINCEPS LUZIFERASEASSAYS 38
3.8.1 GLEICHGEWICHTSBINDUNGSSTUDIEN (BESTIMMUNG DER KD) 38
3.8.2 HOMOLOGE KOMPETITIONSEXPERIMENTE (BESTIMMUNG DER
KJ)
40
3.8.3 BESTIMMUNG DER REZEPTOREN PRO ZELLE 40
3.9 IL8 ELISA 41
3.10 ZYTOTOXIZITAETSASSAY 41
4. ERGEBNISSE 43
4.1 CHARAKTERISIERUNG VON GPL-18DL-LGGL-FUSIONSPROTEINEN 43
4.1.1. KONSTRUKTION UND REINIGUNG DER 18DL-LGGL-FUSIONSPROTEINEN 43
4.1.2 AFFINITAET DER GPL-18DL-LGGL-FUSIONSPROTEINE FUER FNL4 44
4.1.3 VERGLEICH DER GENETISCHEN FUSION VON GPL UND CITRIN AN 18D L-LGG L
47
4.1.4 AFFINITAET DER GPL-18DL-LGGL-FUSIONSPROTEINE FUER FCY-REZEPTOREN 48
4.1.5 GPL-FUSIONIERUNG AN 18D L-LGG L HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE
AGONISTISCHE AKTIVITAET DER ANTIKOERPER NACH
OLIGOMERISIERUNG ODER FCYR-BINDUNG 52
4.2 CHARAKTERISIERUNG VERSCHIEDENER GPL(CT.LC)-18DL-LSOTYP-VARIANTEN 55
4.2.1 REINIGUNG UND GELFILTRATION DER GPL(CT-LC)-18DL-LSOTYP-VARIANTEN
55
4.2.2 AFFINITAET DER NEUEN GPL(CT-LC)-18DL-LSOTYPEN FUER FNL4 UND
FCY-REZEPTOREN 56
4.2.3 AGONISTISCHE AKTIVITAET DER 18DL-LSOTYP-VARIANTEN IN ABHAENGIGKEIT
VON FCYR-BINDUNG 61
4.3. GPL-MARKIERUNG ZUR CHARAKTERISIERUNG VON ANTIKOERPERN IST AUCH FUER
ANDERE TNFRSF-REZEPTOR-SPEZIFISCHE
ANTIKOERPER GEEIGNET 64
4.3.1 AFFINITAETSBESTIMMUNG DER UNTERSUCHTEN CD95-, LTSSR- UND CD40-
SPEZIFISCHEN ANTIKOERPER FUER IHRE
JEWEILIGEN ANTIGENE 65
4.3.2 DIE AKTIVITAET DER CD95-, LTSSR- UND CD40- SPEZIFISCHEN ANTIKOERPER
WIRD DURCH DIE GPL-MARKIERUNG NICHT
BEEINFLUSST 67
5. DISKUSSION 70
5.1 VORTEILE UND NACHTEILE DER GENETISCHEN FUSION DER GAUSSIA PRINCEPS
LUZIFERASE AN ANTIKOERPER 70
5.2 VERGLEICH DER GPL-MARKIERUNG MIT ALTERNATIVEN, POSITIONSSPEZIFISCHEN
MARKIERUNGSTECHNIKEN 75
6. LITERATURVERZEICHNIS 79
7. ANHANG 89
7.1 SEQUENZEN 89
7.2 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
91
PUBLIKATIONEN
XI
LEBENSLAUF
XII
DANKSAGUNG XIV
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