Extrazelluläre Regulation von BMP-7 durch Fibrillin-1:
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| Veröffentlicht: |
Köln
2016
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| adam_text | Titel: Extrazelluläre Regulation von BMP-7 durch Fibrillin-1
Autor: Wohl, Alexander
Jahr: 2016
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung....................................................................................................................... 1
1.1 Knochenmorphogenetische Proteine......................................................................1
1.2 Biosynthese der Mitglieder der TGF-ß Superfamilie...............................................3
1.3 Struktur der Wachstumsfaktoren der TGF-ß Superfamilie.......................................5
1.4 Struktur der TGF-ß Prodomäne im TGF-ß small latent complex..............................6
1.5 BMP-7 Komplex.....................................................................................................8
1.6 Rezeptorbindung der Zytokine der TGF-ß Superfamilie...........................................9
1.7 Regulation der BMP Aktivität durch BMP-bindende Proteine..................................11
1.8 Fibrillin-1 und -2.....................................................................................................13
1.9 Multidomänenstruktur der Fibrilline.........................................................................14
2 Zielsetzung....................................................................................................................17
3 Material und Methoden..................................................................................................18
3.1 Material..................................................................................................................18
3.1.1 Programme und Plattformen zur elektronischen Datenverarbeitung................18
3.1.2 Chemikalien....................................................................................................18
3.1.3 Lösungen und Puffer.......................................................................................20
3.1.4 Laborgeräte.....................................................................................................21
3.1.5 Oligonukleotide...............................................................................................21
3.1.6 Enzyme und Proteine......................................................................................23
3.1.7 Eukaryotische Expressionssysteme................................................................23
3.1.8 Prokaryotische Expressionssysteme...............................................................24
3.1.9 Antikörper........................................................................................................24
3.1.10 Plasmide.........................................................................................................25
3.1.11 Vektorkarten....................................................................................................25
3.1.12 Sonstige Verbrauchsmaterialien......................................................................26
3.2 Molekularbiologische Standardmethoden...............................................................27
3.2.1 PCR (Polymerasekettenreaktion)....................................................................27
3.2.2 Agarose-Gelelektrophorese.............................................................................27
3.2.3 Restriktionsverdau der DNA...........................................................................28
3.2.4 Ligation der DNA............................................................................................28
3.2.5 Transformation von E. coli...............................................................................28
3.3 Zellkulturarbeiten....................................................................................................28
3.3.1 Transfektion und Selektion von eukaryotischen Zellen....................................28
3.3.2 Kultivierung von Zellen und Ernte von Zellkulturüberständen..........................28
3.4 Proteinbiochemische Methoden.............................................................................29
3.4.1 Proteinüberexpression Aufreinigung............................................................29
3.4.2 Überexpression des hBMP-7 Komplexes in HEK293 EBNA Zellen.................30
3.4.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.............................................................31
3.4.4 Gel-Permeations-Chromatographie.................................................................31
3.4.5 Westernblot/ Immunoblot................................................................................32
3.4.6 „Pull down -Assay...........................................................................................33
3.4.7 Separierung von BMP-7 Komplex...................................................................33
3.4.8 Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay (ELISA)...............................................34
3.4.9 Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie...............................................34
3.4.10 Dynamische Lichtstreuung..............................................................................37
3.4.11 CD-Spektroskopie...........................................................................................38
3.4.12 Röntgenkleinwinkelstreuung............................................................................40
3.4.13 T ransmissionselektronenmikroskopie..............................................................41
4 Ergebnisse....................................................................................................................43
4.1 Bestimmung der Wachstumsfaktorbindemotive innerhalb der BMP-7 Prodomäne .43
4.1.1 Sequenzüberlagerung der Prodomänen von Mitgliedern der TGF-ß
Superfamilie....................................................................................................44
4.1.2 Vorhersage der Sekundärstruktur der BMP-7 Prodomäne...............................46
4.1.3 Überexpression und Aufreinigung von Trunkierungsvarianten der BMP-7
Prodomäne.....................................................................................................47
4.1.4 Überexpression und Aufreinigung des BMP-7 Komplexes...............................48
4.1.5 Separierung des BMP-7 Komplexes................................................................49
4.1.6 CD-spektroskopische Analyse der Sekundärstruktur von BMP-7
Prodomänevarianten.......................................................................................51
4.1.7 Sekundärstrukturkarte der BMP-7 Prodomäne basierend auf CD-Messungen
von BMP-7 Prodomänefragmenten...............................................................54
4.1.8 Interaktionsmotiv des Wachstumsfaktors innerhalb der BMP-7 Prodomäne ..56
4.1.9 Überexpression und Aufreinigung von Austauschmutanten der BMP-7
Prodomänen...................................................................................................61
4.1.10 CD-spektroskopische Analyse des P65HRPRP70 Motivs..................................62
4.1.11 Eingrenzung des Interaktionsmotivs des BMP-7 Wachstumsfaktors innerhalb
der Prodomäne...............................................................................................66
4.1.12 Rekonstitution des BMP-7 Komplexes............................................................68
4.1.13 Kompetitionsstudien der BMP-7 Prodomäne und der BMP Typ II Rezeptoren
um die Rezeptorbindestelle des BMP-7 Wachstumsfaktors.............................70
4.1.14 Stabilisierung der BMP-7 Prodomäne-Wachstumsfaktor-Interaktion durch
Dimerisierung der Prodomänen......................................................................72
4.2 Strukturanalyse des BMP-7 Prodomänen-Wachstumsfaktor-Komplexes...............75
4.2.1 Gel-Permeations-Chromatographie des BMP-7 Komplexes...........................75
4.2.2 Dynamische Lichtstreuung des BMP-7 Komplexes.........................................77
4.2.3 Bestimmung der 3D-Oberfläche des BMP-7 Komplexes................................78
4.3 Untersuchungen zur Regulation des BMP-7 Komplexes durch das EZM Protein
Fibrillin-1 ................................................................................................................82
4.3.1 Interaktion von BMP-7 Prodomänefragmenten mit dem N-terminalen Fragment
von Fibrillin-1...................................................................................................82
4.3.2 Überexpression und Aufreinigung der Fibrillin-1 Fragmente rF87 und FUN-
cbEGF.............................................................................................................83
4.3.3 Gel-Permeations-Chromatographie von rF87 und FUN-cbEGF.......................85
4.3.4 BMP-7 Komplexinteraktion mit N-terminalen Fragmenten des Fibrillin-1.........87
4.3.5 Untersuchung des BMP-7 Interaktionsmotivs innerhalb der N-terminalen
Region von Fibrillin-1.......................................................................................89
4.3.6 Abhängigkeit der BMP-7 Komplexinaktivierung von der Beweglichkeit der
Prodomänen cL-Heiix......................................................................................90
4.3.7 Fibrillin-1-bedingte Konformationsänderung im BMP-7 Komplex.....................92
4.3.8 Interaktionsmodell...........................................................................................95
5 Diskussion ..................................................................................................................96
5.1 Die Bindemotive des Wachstumsfaktors innerhalb der BMP-7 Prodomäne............96
5.1.1 Sekundärstrukturvorhersage der BMP-7 Prodomäne......................................96
5.1.2 Ermittlung der Sekundärstruktur der BMP-7 Prodomäne.................................97
5.1.3 Das Interaktionsmotiv des Wachstumsfaktors innerhalb der BMP-7 Prodomäne
......................................................................................................................99
5.1.4 Rekonstitution des BMP-7 Komplexes...........................................................101
5.1.5 Stabilisierung des BMP-7 Komplexes durch Dimerisierung der BMP-7
Prodomänen..................................................................................................102
5.2 Struktur des BMP-7 Prodomänen-Wachstumsfaktor-Komplexes..........................103
5.3 Regulation des BMP-7 Komplexes durch das EZM Protein Fibrillin-1...................107
5.3.1 Interaktion vom BMP-7 Komplex mit der einzigartigen N-terminalen Region in
Fibrillin-1 .......................................................................................................108
5.3.2 Fibrillin-1-bedingte Konformationsänderung und Inaktivierung des BMP-7
Komplexes....................................................................................................109
5.3.3 Modell zur Regulation der in Lösung bioaktiven Vertreter der TGF-ß
Superfamilie..................................................................................................III
6 Zusammenfassung......................................................................................................112
7 Abstract.......................................................................................................................114
8 Abkürzungsverzeichnis...............................................................................................115
9 Tabellenverzeichnis....................................................................................................117
10 Abbildungsverzeichnis.................................................................................................117
11 Literaturverzeichnis.....................................................................................................120
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