GPR91 und GPR99: Expression und Lokalisation der Rezeptoren für Succinat und -Ketoglutarat in Organen der Maus:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Gießen
VVB Laufersweiler Verlag
2016
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| Edition: | 1. Auflage |
| Series: | Edition Scientifique
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | VI, 119 Seiten Illustrationen 21 cm x 14.6 cm, 135 g |
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|---|---|
| adam_text | 1. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
2.
EINLEITUNG.....................................................................................................................................
1
2.1. G-PROTEIN GEKOPPELTE
REZEPTOREN........................................................................................
1
2.2.
GPR91.......................................................................................................................................
3
2.2.1. SUCCINATSPIEGEL UNTER PHYSIOLOGISCHEN UND PATHOLOGISCHEN
BEDINGUNGEN..........3
2.2.2. GPR91-AKTIVIERTE
SIGNALWEGE.......................................................................................7
2.2.3. EXPRESSION, LOKALISATION UND HINWEISE AUF DIE FUNKTION VON GPR91
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN...............................................................................................8
2.3.
GPR99.....................................................................................................................................
11
2.3.1.
LIGANDEN.........................................................................................................................11
2.3.2. GPR99-AKTIVIERTE
SIGNALWEGE.....................................................................................12
2.3.3. EXPRESSION, LOKALISATION UND HINWEISE AUF DIE FUNKTION VON GPR99
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN.............................................................................................12
2.4. FREISETZUNG DER
LIGANDEN....................................................................................................14
2.5. ZIELSETZUNG DER
ARBEIT...........................................................................................................14
3. MATERIAL UND
METHODEN..........................................................................................................16
3.1.
MATERIAL....................................................................................................................................
16
3.1.1.
VERSUCHSTIERE.................................................................................................................16
3.1.2. GERAETE UND
LABORBEDARF..............................................................................................
17
3.1.3. CHEMIKALIEN +
VERBRAUCHSMATERIALIEN.......................................................................19
3.1.4. PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE ORGANENTNAHME UND -AUFBEREITUNG
......................
21
3.1.4.1. VORSPUELLOESUNG FUER DIE PERFUSIONSFIXIERUNG VON MAUSORGANEN
.......................
21
3.1.4.2. 0,1 M UND 0,2 M PHOSPHATPUFFER (P P )
..............................................................
21
3.1.4 3. 4% PARAFORMALDEHYD
(PFA).................................................................................21
3.1.4.4.
ZAMBONIFIXANS........................................................................................................21
3.1.5. PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE
....................................................
21
3.1.5.1. PHOSPHAT-GEPUFFERTE SALINE (PBS)
.....................................................................
21
3.1.5.2. PBS MIT ERHOEHTER SALZKONZENTRATION
(PBS+S).................................................21
3.1.5.3.
BLOCKLOESUNG.............................................................................................................22
3.1.5.4. 10 MM ZITRONENSAEURE PH
6,0...............................................................................22
3.1.5.5. PBS, 0,1% TRITON X-10 0
.......................................................................................22
3.1.5 6. 0,05 M TRIS-HCI PH 7 ,6
......................................................................................
22
3.1.5.7. CARBONAT-GEPUFFERTES
GLYCEROL............................................................................22
3.1.5.8. MOWIOL-EINDECKMEDIUM
.......................................................................................
22
3.1.6. PUFFER UND LOESUNGEN FUER WESTERN
BLOTS....................................................................22
3.1.6.1. 1 M TRIS-HCI PH 6 .8
............................................................................................
22
3.1.6 2. 2 M TRIS-HCI PH 8 .6
............................................................................................23
3.1.6.3. 0,5% UND 20% SODIUM-DODECYLSULFAT (SDS)-LOESUNG
....................................
23
3.1.6.4.
HARNSTOFFEXTRAKTIONSPUFFER....................................................................................23
3.1.6.5. 10% AMMONIUMPERSULFAT
(APS)..........................................................................23
3.1.6.6.
TRANSFER-PUFFER.......................................................................................................
23
3.1.6.7. 10X
ELEKTROPHORESE-PUFFER....................................................................................
23
3.1.6.8. 2,5X UND 5X PROBENPUFFER FUER DIE GELELEKTROPHORESE
.....................................
23
3.1.6.9. 10X TRIS-BUFFERED SALINE (T B S
)..........................................................................23
3.1.6.10. TWEEN 20 IN TBS (TTB S
)....................................................................................24
3.1.6.11. 2,5%, 5% UND 10%
TTBS-MILCHPULVER..............................................................
24
3.1.7.
ANTIKOERPER........................................................................................................................24
3.2.
METHODEN................................................................................................................................25
3.2.1.
ORGANENTNAHMEN..........................................................................................................25
3.2.1.1. TOETEN DER MAUS ZUR
ORGANENTNAHME.................................................................
25
3.2.1.2. GEWINNUNG VON UNFIXIERTEN ORGANEN
.................................................................
26
3.2.1.3. GEWINNUNG VON FIXIERTEN ORGANEN UND IHRE EINBETTUNG
..................................
26
3.2.2.
IMMUNHISTOCHEMIE........................................................................................................29
3.2.2.1. HERSTELLUNG VON
GEFRIERSCHNITTEN........................................................................
29
3.2.2 2. AUSTESTUNG VON VERSCHIEDENEN FIXANTIEN FUER DIE ANTI-GPR91- BZW.
ANTI-GPR99-LMMUNHISTOCHEMIE AN GEFRIERSCHNITTEN VON UNFIXIERT
EINGEFRORENEN
PROBEN...........................................................................................30
3.2.2.3. HERSTELLUNG VON
PARAFFINSCHNITTEN.......................................................................
31
3.2.2.4. IMMUNMARKIERUNG AN PARAFFINSCHNITTEN MIT FLUOROCHROM- BZW. MIT
PEROXIDASE-KONJUGIERTEN
SEKUNDAERANTIKOERPERN...............................................31
3.2.2.5. HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG
(HE-FAERBUNG)......................................................32
3.2.2 6. DOPPELMARKIERUNG MIT FLUOROCHROM-KONJUGIERTEN
SEKUNDAERANTIKOERPEM ...32
3.2.2.7. DOPPELMARKIERUNG VON GPR91 MITTELS PEROXIDASE-KONJUGIERTEM
SEKUNDAERANTIKOERPER UND FITC-KONJUGIERTEM ANTI-A-SMA
.............................
32
3.2.2.6. KOLOKALISATION VON GPR99 UND
CHAT................................................................ 32
3.2.2.9.
PRAEABSORPTION..........................................................................................................33
3.2.2.10. AUSWERTUNG DER IMMUNHISTOCHEMIE
.................................................................
33
3.2.3. POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND WESTERN
BLOTTING.......................................35
3.2.3.1.
PROTEINEXTRAKTE.......................................................................................................
35
3.2.3.2. PROTEINBESTIMMUNG NACH
BRADFORD.....................................................................35
3.2.3.3. HERSTELLUNG DER
ELEKTROPHORESE-GELE................................................................
35
3.2.3.4.
ELEKTROPHORESE.......................................................................................................
36
3.2.3.5. WESTERN
BLOT..........................................................................................................
37
3.2.3.6.
PRAEABSORPTIONSKONTROLLE........................................................................................
38
3.2.3.7. DENSITOMETRISCHE ANALYSE DER IMMUNREAKTIVEN
BANDEN................................36
3.2.38.
STATISTIK....................................................................................................................36
4.
ERGEBNISSE...............................................................................................................................
39
4.1. UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET DER ANTIKOERPER GEGEN GPR91 BZW. GPR99 IM
WESTERN
BLOT...........................................................................................................................39
4.2. ANALYSE DER EXPRESSION VON GPR91 IN ORGANEN DER MAUS MITTELS
WESTERN BLOT
.....
41
4.3. IMMUNHISTOCHEMISCHE LOKALISATION VON GPR91 UND GPR99 IN ORGANEN
DER M
AUS................................................................................................................................
43
4.3.1. OPTIMIERUNG DER ANTI-GPR91 - BZW. ANTI-GPR99-LMMUNHISTOCHEMIE
................
43
4.3.2. LOKALISATION VON GPR91 IN ORGANEN DER
MAUS.......................................................43
4.3.2.1.
UROGENITALTRAKT........................................................................................................
43
4.3.2.2.
NEBENNIERE.............................................................................................................52
4.3.2.3.
SPEICHELDRUESEN......................................................................................................54
4.3.2.4.
GASTROINTESTINALTRAKT..............................................................................................56
4.3.25. M
ILZ...........................................................................................................................62
4.3.2.6.
FETTGEWEBE.............................................................................................................63
4.3.2.7.
NERVENSYSTEM........................................................................................................
64
4.3.3. LOKALISATION VON GPR99 IN ORGANEN DER
MAUS............................................... 67
4.3.3.1.
UROGENITALTRAKT........................................................................................................67
4.3.3.2.
NEBENNIERE.............................................................................................................73
4.3.3.3.
SPEICHELDRUESEN......................................................................................................73
4.3.3.4.
GASTROINTESTINALTRAKT..............................................................................................76
4.3.3.5.
NERVENSYSTEM........................................................................................................78
5.
DISKUSSION................................................................................................................................80
5.1. ANTI-GPR91 UND ANTI-GPR99 IM WESTERN BLOT UND DER INDIREKTEN
IMMUNFLUORESZENZ................................................................................................................
80
5.1.1. SPEZIFITAET VON ANTI-GPR91 UND AUSSAGEKRAFT DER METHODE WESTERN
BLOT..........80
5.1.2. SPEZIFITAET DER VERWENDETEN ANTIKOERPER IN DER IMMUNHISTOCHEMIE
.......................
80
III
5.2. VORKOMMEN VON GPR91 81
5.3. VORKOMMEN VON G P R
99....................................................................................................95
5.4. SCHLUSSFOLGERUNG UND
AUSSICHTEN...................................................................................
100
6.
ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................
102
7.
SUMMARY..................................................................................................................................104
8.
LITERATURVERZEICHNIS................................................................................................................
106
9.
ERKLAERUNG..................................................................................................................................118
10.
DANKSAGUNG............................................................................................................................119
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