STAT activation in primary human lymphocytes is an immediate effect of the herpesvirus saimiri oncoprotein tip: = Die Aktivierung von STAT Faktoren in primären humanen Lymphozyten ist ein unmittelbarer Effekt des viralen Onkoproteins Tip von Herpesvirus saimiri
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| Veröffentlicht: |
Erlangen ; Nürnberg
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
2016
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STAT ACTIVATION IN PRIMARY HUMAN LYMPHOCYTES IS AN IMMEDIATE
EFFECT OF THE HERPESVIRUS SAIMIRI ONCOPROTEIN TIP
DIE AKTIVIERUNG VON STAT FAKTOREN IN PRIMAEREN HUMANEN
LYMPHOZYTEN IST EIN UNMITTELBARER EFFEKT DES
VIRALEN ONKOPROTEINS TIP VON HERPESVIRUS SAIMIRI
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET
DER FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET ERLANGEN-NUERNBERG
ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DR. RER. NAT.
VORGELEGT VON
NINA KOEHLER
AUS ERLANGEN
TABLE OF CONTENTS
1. SUM
MARY.1
2.
ZUSAMMENFASSUNG.2
3.
INTRODUCTION.
3
3.1.
GAMMAHERPESVIRINAE.3
3.1.1. HERPESVIRUS SAIMIRI
.
4
3.1.1.1. HVS GENOME STRUCTURE AND
REPLICATION.5
3.1.1.2.
ONCOGENESIS.6
3.1.1.3. TROPISM OF
HVS.7
3.2. SIGNAL TRANSDUCERS AND ACTIVATORS OF TRANSCRIPTION (STATS)
.
8
3.2.1.
STATS.
11
3.3. THE SRC FAMILY TYROSINE KINASE
LCK.
12
3.4. NATURAL KILLER CELLS
.
13
4.
RATIONALE.15
5. MATERIALS AND
METHODS.16
5.1.
MATERIAL.16
5.1.1. REAGENTS AND
SOLUTIONS.16
5.1.2. BUFFERS AND
SOLUTIONS.18
5.1.3. MARKERS FOR
ELECTROPHORESIS.
19
5.1.4.
MEDIA.19
5.1.4.1. MEDIA FOR BACTERIA
CULTURE.
19
5.1.4.2. REAGENTS AND MEDIA FOR EUKARYOTIC CELL CULTURE
.
19
5.1.5.
CELLS.
20
5.1.5.1. PROKARYOTIC
CELLS.
20
5.1.5.2. EUKARYOTIC
CELLS.
20
5.1.6.
VECTORS.
20
5.1.7.
ANTIBODIES.
22
5.1.8
OLIGONUCLEOTIDES.
23
5.2.
METHODS.
24
5.2.1. STANDARD
METHODS.
24
5.2.2. CELL
CULTURE.
24
JURKATT
CELLS.24
PBMC
.
.24
NK
CELLS.
25
5.2.3. CELL PURIFICATION OF NK
CELLS.
25
5.2.4. ELECTROPORATION OF JURKAT T CELLS
. .
25
5.2.5.
IMMUNOFLUORESENCE.
26
5.2.6.
IMMUNOBLOT.26
5.2.7. FIREFLY LUCIFERASE REPORTER ASSAY
. .
27
5.2.8. OLIGONUCLEOTIDE PULLDOWN
.
.
.27
5.2.9. MRNA IN VITRO
TRANSCRIPTION.
28
5.2.10. MRNA-ELECTROPORATION OF
PBMC. 26
5.2.11. FLOW
CYTOMETRY.29
5.2.12. POLYMERASE CHAIN REACTION
(PCR). 29
5.2.13. REVERSE
TRANSCRIPTION.30
5.2.14. QUANTITATIVE
PCR.
.
30
5.2.15. CYTOTOXICITY
ASSAY.31
6.
RESULTS.32
6.1. STATS ACTIVATION IN JURKAT T CELLS BY THE VIRAL ONCOPROTEIN T IP
.32
6.1.1. STATS PHOSPHORYLATION IS DEPENDENT ON TYROSINE RESIDUE 127 OF TIP
.
32
6.1.2. NUCLEAR TRANSLOCATION OF PSTAT5
. .
33
6.1.3. DNA BINDING OF PSTAT5
.
35
6.1.4. TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF TIP ACTIVATED
STATS.36
6.2. STAT ACTIVATION BY TIP IN PRIMARY HUMAN
LYMPHOCYTES.37
6.2.1. PRIMARY HUMAN T CELLS
.
37
6.2.1.1. EXPRESSION SYSTEM FOR TIP IN VITRO
TRANSCRIPTION.37
6.2.1.2. ISOLATION OF HUMAN PBMC
.
.
40
6.2.1.3. ACTIVATION OF STATS BY TIP IN HUMAN PBMC
.
40
6.2.1.3. ACTIVATION OF STAT3 AND STAT6 BY TIP IN HUMAN
PBMC.44
6.2.1.4. STAT PHOSPHORYLATION BY TIP IN HUMAN PBMC IS DEPENDENT ON A
SRC-
FAMILY
KINASE.
45
6.2.1.5. EXPRESSION OF STAT TARGET GENES
.
47
6.2.2. NK
CELLS.
49
6.2.2.1. UNTOUCHED ISOLATION OF HUMAN NK CELLS.
.
49
6.2.1.2. STAT ACTIVATION BY TIP IN PRIMARY HUMAN NK CELLS
.
50
6.2.1.4. STAT ACTIVATION BY TIP IS DEPENDENT ON SRC FAMILY KINASES
.
51
6.2.1.3. CYTOTOXICITY OF NK CELLS INDUCED BY
TIP.53
7.
DISCUSSION.54
7.1. STAT5 ACTIVATION IN JURKAT T CELLS IS DEPENDENT ON TYROSINE RESIDUE
127 OF TIP 54
7.2. STAT ACTIVATION IN PRIMARY HUMAN
PBMC.57
7.3. TIP MIMICS IL-2
SIGNALING.59
7.4. ACTIVATION OF STAT FACTORS IS DEPENDENT ON SRC KINASE
FAMILY.60
7.5. TRANSCRIPTION OF STAT TARGET
GENES.62
7.6. STAT ACTIVATION IN HUMAN NK CELLS BY
TIP. 63
8.
ABBREVIATIONS.66
9.
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