Die Variabilität des Ratten iNKT TCR: = The Variability of The Rat iNKT TCR
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Würzburg
2015
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DIE VARIABILITAET DES RATTEN INKT TCR
THE VARIABILITY OF THE RAT INKT TCR
D ISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN D OKTORGRADES
DER G RADUATE
SCHOOL OF LIFE SCIENCES
*
JULIUS-M AXIM ILIANS-U NIVERSITAT W UERZBURG
K LA S E INFEKTION UND IM M UNITAET
VORGELEGT VON
DANIEL SYLVESTER P ALETTA
AUS
AUGSBURG
W UERZBURG 2015
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 T
ZELLPOPULATIONEN.
2
1.2 CDL FAM
ILIE.
3
1.2.1 CD LD ANTIGENPRAESENTATION
.
4
1.3 INKT
ZELLEN.
5
1.3.1 ENTWICKLUNG VON INKT Z ELLEN
.
5
1.3.2 FUNKTION VON INKT Z
ELLEN.
7
1.3.3 INTERAKTIONEN DES INKT T C R
.
8
1.3.4 INKT ZELLEN DER R A T T E
.
10
1.4 ZIEL DIESER A R B E
IT.
11
2 MATERIAL UND METHODEN 12
2.1 M A TE RIA LIE N
.
12
2.1.1 T
IERE.
12
2.1.2 ZELLLINIEN
.
12
2.1.3 R E A G E N Z IE N
.
13
2.1.4 MEDIEN, PUFFER UND L OE SU N G EN
.
15
2.1.5
VEKTOREN.
20
2.1.6
OLIGONUKLEOTIDE.
22
2.1.7 ANTIKOERPER UND O LIGOM
ERE.
23
2.1.8 K I T S
.
24
2.1.9 G E RAE TE
.
25
2.1.10 VERBRAUCHSMATERIAL
.
26
2.1.11 COMPUTERSOFTWARE UND IN TERN ETAD RESSEN
.
27
2.2 METHODEN
29
2.2.1 MIKRO- UND MOLEKULARBIOLOGISCHE M E TH O D E N
.
29
2.21.1 RESTRIKTIONSVERDAU UND LIGATION VON INSERT UND VEKTOREN . . . 29
2.2.1.2 GELELEKTROPHORESE UND DNA EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN . . . 29
2.2.1.3 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN
. 29
2.2.1.4 DNA MINI- UND MIDIPRAEPARATION ZUR ISOLIERUNG VON PLASMIDEN 29
2.2.1.5 ISOLIERUNG VON N
UKLEINSAEUREN. 30
2.2.1.6 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN . 30
2.2.1.7 CDNA SYNTHESE
.
31
2.21.8 SEQUENZIERUNG VON D N A
. 31
2.2.1.9 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE VON TCRA KETTEN . 32
2.2.1.10 KLONIERUNG DES HUMANEN CDLD IN P X I G
.
33
2.2.1.11 KLONIERUNG DES HUMANEN INKT TCR . 34
2.2.1.12 KLONIERUNG DER RBV8S2 SS K E T T E
.
34
2.2.1.13 AUSTAUSCH DES CDR3SS S EGM ENTS
.
34
2.2.1.14 ANALYSE VON RA V L* TCRA K E TTE N
.
35
2.2.1.15 ANALYSE DER TCR0 K E T T E
. 35
2.2.2 PROTEINBIOCHEMISCHE M E TH O D E N
. 35
2.2.2.1 SD S-PA G
E.
35
2.2.2.2 MAUS IL-2 E L I S A
.
37
2.2.2.3 MAUS G G I E L IS A
.
37
2.2.2.4 CD LD E L IS A
.
37
2.2.2.5 PRODUKTION VON CDLD D IM
EREN. 37
2.2.2.6 BELADUNG VON CDLD D IM
EREN. 38
2.2.2.7 BESCHICHTUNG VON PAN MLGG DYNABEADS . 38
2.2.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
.
39
2.2.3.1 ZELLLKULTUR
.
39
2.2.3.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN
.
39
2.2.3.3 TRANSFEKTION VON JJ58L . 39
2.2.3.4 RETROVIRALE T RAN SD U K TIO N
. 39
2.2.3.5 STIMULATION VON T RAN SD U K TAN TEN
. 40
2.2.3.6 STIMULATION EXPANDIERTER RATTEN INKT ZELLEN . 41
2.2.3.7 PRAEPARATION VON THYM OCYTEN
.
41
2.2.3.8 PRAEPARATION VON MILZZELLEN
.
. 41
2.2.3.9 PRAEPARATION VON INTRAHEPATISCHEN LYMPHOCYTEN . 41
2.2.3.10 EXPANSION VON INKT
ZELLEN. 42
2.2.3.11 LANGZEITKULTUR ISOLIERTER INKT ZELLEN . 42
2.2.3.12 FUSION VON EXPANDIERTEN F344 MILZZELLEN . 43
2.2.3.13 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE VON Z
ELLEN. 43
2.2.3.14 STATISTISCHE ANALYSE VON D A TE N
. 44
2.2.3.15 MOLEKULARE M
ODELLIERUNGEN.
44
3 ERGEBNISSE 45
3.1 CDLD DIMERE ALS HILFSMITTEL ZUR UNTERSUCHUNG VON INKT ZELLEN
. 45
3.1.1 GENERIERUNG HUMANER CDLD D IM E R E
. 45
3.1.2 VERGLEICH VON
BELADUNGSBEDINGUNGEN.
47
3.2 IN VITRO CDLD
DIMERBINDUNGSSTUDIEN.
53
3.2.1 UNTERSUCHUNG DES CDR2* UND H V 4
A. 55
3.2.2 UNTERSUCHUNG DES V-J UE
BERGANGS.
58
3.2.3 UNTERSUCHUNG DER SS K E T T E
.
62
3.3 TCR EXPRESION IN RATTEN INKT Z E LLE N
. 64
3.3.1 EXPANSION VON RATTEN INKT
ZELLEN. 64
3.3.2
*** EXPRESION IN F344 INKT
ZELLEN. 66
3.3.3 B V EXPRESSION IN F344 INKT Z ELLEN
. 68
4 DISKUSSION 75
4.1 BELADUNG VON CDLD D IM E RE N
.
75
4.2 CDLD DIMERBINDUNGSSTUDIEN
.
80
4.3 TCR EXPRESION VON RATTEN INKT Z E LLE N
. 88
4.4 A
USBLICK.
92
5 ZUSAMMENFASSUNG 95
6 SUMMARY 98
ABB*LDUNGSVERZEICHNIS 101
TABELLENVERZEICHNIS
LITERATURVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG
LEBENSLAUF
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