Phänotypische und funktionelle Charakterisierung inflammatorischer Zellen in der Tumorprogression des Pankreaskarzinoms:
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Marburg
2015
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| adam_text | AUS DEM MED. ZENTRUM FUER INNERE MEDIZIN,
SCHWERPUNKT GASTROENTEROLOGIE, ENDOKRINOLOGIE UND STOFFWECHSEL
GESCHAEFTSFUEHRENDER DIREKTOR: PROF. DR. MED. T. M. GRESS
DES FACHBEREICHS MEDIZIN DER PHILIPPS-UNIVERSITAET MARBURG
PHAENOTYPISCHE UND FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG INFLAMMATORISCHER
ZELLEN IN DER TUMORPROGRESSION DES
T
PANKREASKARZIOMS
PHILIPPS
UNIVERSITAET
MARBURG
INAUGURAL-DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES
DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DEM FACHBEREICH MEDIZIN DER PHILIPPS-UNIVERSITAET MARBURG
VORGELEGT VON
LEONIE MUEHLBERG (GEB. GRETHE)
AUS KARLSRUHE
MARBURG, 2015
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 6
1.1 DIE DUKTALE PANKREASADENOKARZINOM (PDAC) 7
1.2 DAS STROMA DES DUKTALEN PANKREASADENOKARZINOMS 9
1.3 DIE MAKROPHAGEN ALS BESTANDTEIL IM STROMA DES PANKREASKARZIOMS 11
1.4 MICRORNA 13
1.5 ZIELSETZUNG 19
.2. MATERIAL UND METHODEN 20
2.1 MATERIAL 20
2.1.1 LABORGERAETE 20
2.1.2 VERBRAUCHSMATERIAL 22
2.1.3 CHEMIKALIEN 24
2.1.4 ENZYME 24
2.1.5 STANDARDS 24
2.1.6 PRIMER, SIRNAS UND MIMICS 25
2.1.7 PLASMIDE 29
2.1.8 ANTIKOERPER 29
2.1.9 REAGENZIEN UND KITS 31
2.1.10 MATERIALEN FUER DIE KULTUR VON ZELLEN 32
2.1.11 BIOLOGISCHES MATERIAL 34
2.1.12 SOFTWARE 36
2.2 METHODEN 36
2.2.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURMETHODEN 36
2.2.2 ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG PRIMAERER ZELLEN 37
2.2.3 EINBRINGEN VON NUKLEINSAEUREN IN EUKARYOTISCHE ZELLEN 40
2.2.4 KOKULTUREXPERIMENTE 42
2.2.5 METHODEN IM UMGANG MIT NUKLEINSAEUREN 43
2.2.6 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 45
2.2.7 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 48
2.2.8 GEWEBEFAERBUNGEN 49
2.2.9 STATISTISCHE ANALYSE 49
3. ERGEBNISSE 50
3.1 ISOLATION UND PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON MAKROPHAGEN AUS
MAUSMODELLEN DER PANKREASKARZINOGENESE 50
3.2 CHARAKTERISIERUNG DER MIRNA-EXPRESSION VON CD11
B
+
-ZELLEN IN DER
PANKREASKARZINOGENESE 61
3.2.1 ANALYSE DES MIRNA-EXPRESSIONSPROFILS IN MURINEN CD11
B*-ZELLEN
AUS PANKREATA WAEHREND DER TUMORPROGRESSION 62
3.2.2 VALIDIERUNG DER MIRNA-EXPRESSIONSPROFILE IN CD11
B*-ZELLEN 63
3
INHALTSVERZEICHNIS
3.3 FUNKTIONELLE ANALYSE DER MIR-21 IN PRIMAEREN MURINEN BMD-MAKROPHAGEN
..64
3.3.1 ETABLIERUNG EINER TRANSFEKTIONSMETHODE FUER PRIMAERE MURINE BMD-
MAKROPHAGEN 65
3.3.1.1 ELEKTROPORATION MURINER PRIMAERER BMD-MAKROPHAGEN MIT SIRNA ...65
3.3.1.2 ELEKTROPORATION MURINER PRIMAERER BMD-MAKROPHAGEN MIT MIMIC-21
-
3P UND INHIBITOR-21
-3P 66
3.3.1.3 TRANSFEKTION MIT LIPIDBASIERTEN REAGENZIEN IN DER MURINEN
MAKROPHAGENZELLLINIE J774 66
3.3.1.4 ELEKTROPORATION VS. TRANSMESSENGER-TRANSFEKTION VON MURINEN
PRIMAEREN BMD-MAKROPHAGEN 67
3.3.1.5 FAZIT DER ETABLIERUNG EINER TRANSFEKTIONSMETHODE IN MURINE
PRIMAERE
BMD-MAKROPHAGEN 69
3.3.2 EINFLUSS DER MIR-21 AUF PHAENOTYP UND FUNKTION VON MURINEN
PRIMAEREN BMD-MAKROPHAGEN 70
3.3.2.1 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES DER MIR-21
-3P-MODULATION AUF DIE
MRNA-EXPRESSION IN MAKROPHAGEN 70
3.3.2.2 UNTERSUCHUNG DER PROTEINEXPRESSION BEKANNTER MIR-21-ZIELGENE
UNTER MODULATION DER MIR-21-3P UND MIR-21-5P 78
3.3.2.3 EINFLUSS DER MIR-21-EXPRESSION AUF DIE ZYTOKINSEKRETION VON
MAKROPHAGEN 82
3.3.2.4 EINFLUSS DER MIR-21-ABHAENGIGEN REGULATION VON MIP-1A UND CXCL-
10 AUF DIE MIGRATION VON CD8* T-ZELLEN 84
3.4 ANALYSE DER AUSWIRKUNGEN EINER KONSTITUTIVEN KRAS- AKTIVIERUNG IN
DUKTALEN
ZELLEN DES PANKREAS AUF MAKROPHAGEN 86
3.4.1 ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG GEEIGNETER ZELLSYSTEME 87
- 3.4.1.1 GENERIERUNG VON HPDE-KRAS
G,2V
ALS ZELLMODELL
FUER EIN FRUEHES
STADIUM IN DER PANKREASKARZINOGENESE 87
3.4.1.2 GENERIERUNG HUMANER MAKROPHAGEN ALS MODELL FUER TUMORASSOZIIERTE
MAKROPHAGEN (TAM) 95
3.4.2 EINFLUSS DER EXPRESSION VON ONKOGENEM KRAS IN HPDE-ZELLEN AUF
DEN PHAENOTYP VON KOKULTIVIERTEN MAKROPHAGEN 99
3.4.3 EINFLUSS VON KRAS-INDUZIERTEN ZYTOKINEN AUF DEN PHAENOTYP VON
MAKROPHAGEN IN VITRO 108
3.5 ANALYSE DER INDUKTION DER MIR-21
-3P/5P-EXPRESSION IN HUMANEN
MAKROPHAGEN 113
3.6 ANALYSE DER INDUKTION DER MIR-21
-3P/5P-EXPRESSION IN MURINEN CD11
B*-
MAKROPHAGEN 114
4
INHALTSVERZEICHNIS
4.0 DISKUSSION 116
4.1 MODELLSYSTEME FUER DIE UNTERSUCHUNG DER MAKROPHAGENPOLARISATION 116
4.2 DIE POLARISIERUNG VON MAKROPHAGEN WAEHREND DER PANKREASKARZINOGENESE
119
4.3 DIE ABERRANTE EXPRESSION DER MIR-21 IM PANKREASKARZIOM 121
4.4 DIE MIR-21 ALS MODULATOR DER POSTTRANSKRIPTIONELLEN GENEXPRESSION IN
MAKROPHAGEN 125
4.5 DIE KRAS-ABHAENGIGE POLARISATION V. MAKROPHAGEN IM PANKREASKARZIOM
.129
4.6 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK 133
5. ZUSAMMENFASSUNG 136
6. LITERATURVERZEICHNIS 139
7. ANHANG 157
8. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 190
9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 194
10. TABELLENVERZEICHNIS 198
VERZEICHNIS AKADEMISCHER LEHRER 199
DANKSAGUNG 2000
5
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