Etablierung und Evaluierung eines Capture-ELISAs zum Nachweis des Beta2-Toxins von Clostridium perfringens aus Feldisolaten:
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| Published: |
Gießen
VVB Laufersweiler Verlag
2015
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| Series: | Edition Scientifique
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS......................................................................................................I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.........................................................................................VI
1
EINLEITUNG....................................................................................................................1
2
SCHRIFTTUM...................................................................................................................2
2.1 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
BETA2-TOXIN.......................................................................
2
2.2 INAKTIVIERUNG UND DEGRADATION DES
BETA2-TOXINS.................................................3
2.3 DIE
BETA2-TOXIN-VARIANTEN.......................................................................................
4
2.4 DIE REGULATION DER
BETA2-TOXIN-EXPRESSION...........................................................6
2.5 ZUR FRAGE DER PATHOGENETISCHEN BEDEUTUNG DES BETA2-TOXINS
...........................
8
2.6 DIE TOXISCHE WIRKUNG DES
BETA2-TOXINS................................................................
10
2.7 DER NACHWEIS VON BETA2-TOXIN BZW. SEINES GENS
CPB2........................................12
3 MATERIAL UND
METHODEN...........................................................................................
16
3.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME
...............................................................................
16
3.2 ANZUCHT DER BAKTERIENSTAEMME
...............................................................................
18
3.3
AMMONIUMSULFATFAELLUNG..........................................................................................19
3.4
DIALYSE.......................................................................................................................
19
3.5
PROTEINBESTIMMUNG..................................................................................................19
3.6 HERSTELLUNG DES REKOMBINANTEN BETA2-TOXINS IN
E.COLI.......................................20
3.6.1 ANZUCHT DES TOP
10F PHIT-VIC-40..........................................................................20
3.6.2 EXPRESSION UND
INDUKTION...........................................................................................
20
3.6.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE AUFFEINIGUNG DES REKOMBINANTEN
BETA2-TOXINS..............................................................................................................21
3.7 HERSTELLUNG VON POLYKLONALEM ANTI-BETA2-SERUM IN DER MAUS
UND IM
KANINCHEN....................................................................................................21
3.7.1
TIERVERSUCHE...............................................................................................................21
3.7.2
VERSUCHSTIERE.............................................................................................................
22
3.7.3
IMPFANTIGEN................................................................................................................
22
3.7.4
IMPFSCHEMATA............................................................................................................
22
3.7.5
SERUMGEWINNUNG.......................................................................................................
22
3.8 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE).........................................23
3.9
IMMUNOBLOTVERFAHREN..............................................................................................24
3.10 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER
..................................................................
25
3.10.1
VERSUCHSTIERE..............................................................................................................
25
3.10.2
IMPFSCHEMA................................................................................................................
25
3.10.3 PRAEPARATION MURINER PERITONEALMAKROPHAGEN
............................................................
26
3.10.4 MYELOMZELLLINIE UND FUSIONSTECHNIK
........................................................................
27
3.10.5 ELISA ZUM NACHWEIS BETA2-TOXIN-ANTIKOERPER
PRODUZIERENDER
HYBRIDOMAZELLEN...............................................................................29
3.10.6
KLONIERUNG..................................................................................................................
29
3.10.7 MASSENPRODUKTION DER MONOKLONALEN
ANTIKOERPER.....................................................30
3.10.8
SUBKLASSENBESTIMMUNG..............................................................................................30
3.10.9 AUFREINIGUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER
MITTELS.................................................30
PROTEIN G-SEPHAROSE
3.10.10 ELISA ZUM NACHWEIS VON MAUS-IMMUNGLOBULINEN DER KLASSE
................................
31
IGG
3.11 TITRATION DER ANTIKOERPER UND DES
ANTIGENS.......................................................... 32
3.11.1 FANGANTIKOERPER (BETA2-SPEZIFISCHE MAK 2-4A5 UND 2-4C11)
....................................
32
3.11.2 NACHWEISANTIKOERPER (BETA2-SPEZIFISCHES POLYKLONALES SERUM VOM
KANINCHEN)... .32
3.11.3 REKOMBINANTEN
BETA2-TOXIN......................................................................................33
3.12 KOMPETITIVER
EPITOP-ELISA...................................................................................33
3.13 ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE ZUR AUFREINIGUNG
DES
BETA2-TOXINS.......................................................................................................
34
3.14 IMMUNOMAGNETISCHE
PROTEIN-ISOLATION.................................................................
35
3.15 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET
DES BETA2-TOXINS VON C.
PERFRINGENS.......................................................................36
3.15.1
IN-VITRO-TESTVERFAHREN................................................................................................36
3.15.1.1 EIGELBAGAR-DIFFUSIONS-T RUEBUNGSTEST
.........................................................................
36
3.15.1.2
ZELLKULTURTEST...............................................................................................................
36
3.15.2
IN-VIVO-TESTVERFAHREN.................................................................................................39
3.15.2.1
TIERVERSUCHE...............................................................................................................
39
3.16
HAEMOLYSEVERSUCHE....................................................................................................39
3.16.1 GEWINNUNG VON
KANINCHENERYTHROZYTEN...................................................................
39
3.16.2 PRAEPARATION VON ERYTHROZYTENMEMBRANFRAGMENTEN MITTELS
FRAKTIONIERTER
ZENTRIFUGATION......................................................................................40
3.16.3 UNTERSUCHUNG ZUR HAEMOLYTISCHEN WIRKUNG EINES ALPHATOXIN
BETA2-TOXIN-GEMISCHES AN KANINCHEN- UND FERKELERYTHROZYTEN
...........................
40
3.16.4 UNTERSUCHUNG ZUR HAEMOLYTISCHEN WIRKUNG DES ALPHATOXIN-BETA2-TOXIN
GEMISCHES NACH PRAEINKUBATION MIT DEM MAK 2-4C11
............................................
40
3.16.5 UNTERSUCHUNG ZUR HAEMOLYTISCHEN WIRKUNG EINES BETA2-
POSITIVEN C. PERFRINGENS TYP A-FELDISOLATES NACH
PRAEINKUBATION MIT DEM MAK 2-4C11
........................................................................
42
4
ERGEBNISSE..................................................................................................................
43
4.1 NACHWEIS DER BINDUNGSREAKTION DES BETA2-SPEZIFISCHEN
HYPERIMMUNSERUMS GEGENUEBER DEM RBETA2-TOXIN IM IMMUNOBLOT
................
43
4.2 NACHWEIS DER FRAKTIONIERTEN ELUTION DES BETA2-TOXINS IN
DER SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)..................................44
4.3 NACHWEIS DES NATIVEN BETA2-TOXINS IN C. PERFRINGENS-
KULTURUEBERSTAENDEN MITTELS BETA2-SPEZIFISCHEN POLYKLONALEN
SERUMS VON DER
MAUS..............................................................................................45
4.3.1 PROZENTUALE VERTEILUNG BETA2-POSITIVER TYP A- UND
TYP C -KULTURUEBERSTAENDE VON BETA2-TOXINGEN-POSITIVEN ISOLATEN
.........................
46
4.3.2 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER TOXINBILDUNG DES BETA2-TOXINS AUS
C. PERFRINGENS KULTURUEBERSTAENDEN IM
IMMUNOBLOT...................................................46
4.4 BESTIMMUNG BETA2-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER IM KANINCHENSERUM
....................
48
4.4.1 OPTIMALE MENGE DES NACHWEISANTIKOERPERS (BETA2-SPEZIFISCHES SERUM
VOM
KANINCHEN) IM CAPTURE
ELISA.................................................................................
49
4.5 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN
ANTIKOERPER...............................................50
4.5.1 EPITOPSPEZIFITAET, IMMUNGLOBULINSUBKLASSEN UND REINHEITSGRAD
..............................
50
4.6 ETABLIERUNG DES BETA2-SPEZIFISCHEN
CAPTURE-ELLSAS.........................................52
4.6.1 BESTIMMUNG DER OPTIMALEN KONZENTRATION DES FANGANTIKOERPERS
...............................
52
4.6.2 NACHWEISGRENZE DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER 2-4A5
UND 2-4C11 AUF NUNC-MAXISORP-PLATTEN
.................................................................
54
4.6.3 AUFBAU DES BETA2-SPEZIFISCHEN
CAPTURE-ELISAS.....................................................55
4.6.4 NACHWEISGRENZE FUER DAS REKOMBINANTE BETA2-TOXIN IM CAPTURE
ELISA................58
4.6.5
INTRA-ASSAY-PRAEZISION.................................................................................................
59
4.6.6
INTER-ASSAY-PRAEZISION.................................................................................................
60
4.6.7 SENSITIVITAET DES
CAPTURE-ELISAS................................................................................62
4.6.8 SPEZIFITAET DES
CAPTURE-ELISAS...................................................................................63
4.6.9 UNTERSUCHUNG VON C. PERFRINGENS-KULTURUEBERSTAENDEN AUS KOTPROBEN
VON GESUNDEN UND KRANKEN SAUGFERKELEN MITTELS
BETA2-SPEZIFISCHEN
CAPTURE-ELISAS.........................................................................64
4.7 GEWINNUNG VON NATIVEM BETA2-TOXIN AUS G PERFRINGENS-
KULTURUEBERSTAENDEN..................................................................................................
67
4.7.1 ISOLIERUNG DES NATIVEN BETA2-TOXINS MITTELS
.............................................................
67
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE...........................................................................67
4.7.2 IMMUNOMAGNETISCHE BETA2-TOXINAUFREINIGUNG MITTELS
DYNABEADS........................69
4.8 ERGEBNISSE ZUR BIOLOGISCHEN AKTIVITAET DES REKOMBINANTEN UND
NATIVEN BETA2-TOXINS VON G PERFRINGENS
..............................................................
70
4.8.1 NACHWEIS DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET DES REKOMBINANTEN
BETA2-TOXINS..............................................................................................................
70
4.8.2 ZYTOTOXISCHE WIRKUNG DES REKOMBINANTEN BETA2-TOXINS FUER
VERSCHIEDENE
ZELLLINIEN..............................................................................................
71
4.8.3 ZYTOTOXISCHE WIRKUNG DES NATIVEN BETA2-TOXINS IN VERSCHIEDENEN
ZELLLINIEN
.......
71
4.8.4 NACHWEIS DER HAEMOLYTISCHEN AKTIVITAET DAS ALPHATOXIN VON
C. PERFRINGENS NACH ZUGABE VON RBETA2-TOXIN
........................................................
75
4.8.5 NACHWEIS DER HAEMOLYTISCHEN WIRKUNG VON ALPHATOXIN- UND
BETA2-TOXIN-POSITIVEN G PERFRINGENS-KULTURUEBEVSTAND
NACH PRAEINKUBATION MIT DEM MAK 2-4C I
1................................................................77
4.8.6 NACHWEIS DER HAEMOLYTISCHEN WIRKUNG DES ALPHATOXINS- UND
RBETA2-TOXINS
NACH PRAEINKUBATION MIT DEM MAK
2-4C11................................................................78
5
DISKUSSION..................................................................................................................
80
6
ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................
86
7
SUMMARY...................................................................................................................
87
8
LITERATURVERZEICHNIS................................................................................................
89
9
ANHANG.......................................................................................................................96
9.1
CHEMIKALIEN..............................................................................................................96
9.2
ANTIKOERPERKONJUGATE...............................................................................................
96
9.3
PLASMIDE.....................................................................................................................96
9.4
VERSUCHSTIERE.............................................................................................................96
9.5
KULTURMEDIEN...........................................................................................................
96
9.6 PUFFER UND
LOESUNGEN...............................................................................................
98
9.6.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE PUFFER
............................................................
98
9.6.2 PUFFER FUER DEN ELEKTROTRANSFER MITTELS WESTERN-BLOT-VERFAHREN
...............................
99
9.6.3 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DEN
IMMUNOBIOT................................................................99
9.6.4 PUFFER FUER DIE INDUKTION, EXPRESSION UND AUFREINIGUNG
DES
BETA2-TOXINS......................................................................................................
100
9.6.5 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DEN ELISA
.......................................................................
101
9.6.6 PUFFER FUER HAEMOLYSEVERSUCHE
..................................................................................
102
9.6.7 PUFFER UND LOESUNGEN FUER ZELLKULTURTECHNIKEN
.........................................................
102
9.7 INJEKTIONSNARKOTIKUM
...........................................................................................
103
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| spelling | Sommer, Alexa Verfasser (DE-588)1077578512 aut Etablierung und Evaluierung eines Capture-ELISAs zum Nachweis des Beta2-Toxins von Clostridium perfringens aus Feldisolaten eingereicht von Alexa Sommer, Tierärztin aus Paderborn 1. Auflage 201509 Gießen VVB Laufersweiler Verlag 2015 VIII, 103 Seiten Illustrationen, Diagramme txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Edition Scientifique Dissertation Justus-Liebig-Universität Gießen 2015 Clostridium perfringens cabt ELISA cabt toxins cabt pigs cabt antibody cabt cytotoxicity cabt Doktorarbeit Wissenschaft Uni (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content VVB LAUFERSWEILER Verlag (DE-588)1065553803 pbl Erscheint auch als Online-Ausgabe Sommer, Alexa Etablierung und Evaluierung eines Capture-ELIAs zum Nachweis des Beta2-Toxins von Clostridium perfringens aus Feldisolaten DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028784666&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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