Ubiquitin-Ligasen des ER-assoziierten Proteinabbaus und ihre Substrate:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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Berlin
2015
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| adam_text | I. EINLEITUNG
INHALTSVERZEICHNIS
UBIQUITIN-LIGASEN DES ER-ASSOZIIERTEN PROTEINABBAUS UND IHRE SUBSTRATE 1
ZUSAMMENFASSUNG 3
ABSTRACT 4
INHALTSVERZEICHNIS 5
I. EINLEITUNG 9
1.1. PROTEINFALTUNG 10
1.2. DIE UBIQUITIN-KASKADE 11
1.3. DAS UBIQUITIN-PROTEASOM SYSTEM (UPS) 12
1.4. ER-ASSOZIIERTE DEGRADIERUNG (ERAD) 13
1.4.1 DIE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE (UPR) 14
1.5. AAA-ATPASE 15
1.5.1 CDC48A/CP/P97 16
1.6. UBX-PROTEINE 19
1.6.1 SHP1 19
1.6.1.1. REGULATION DER PROTEIN-PHOSPHATASE-1 (PP1) 19
1.6.1.2. MODULATION DES NF-KB SIGNALWEGES 23
1.6.1.3. PROTEINDEGRADIERUNG 23
1.6.2 UBX7 25
I.6.2.1. DAS HUMANE UBX7-ORTHOLOG ERASIN 26
1.7. ZIELSETZUNG 27
II. ERGEBNISSE 29
11.1. SILAC 29
11.1.1 METABOLISCHE KONVERSION VON AMINOSAEUREN 29
11.1.2 PROTEOMANALYSE 31
11.1.3 EVALUIERUNG DER PROBENVERARBEITUNG 31
11.1.4 EVALUIERUNG DER MS-ANALYSE 34
11.1.5 CHARAKTERISIERUNG SIGNIFIKANT VERAENDERTER PROTEINE 37
II.1.5.1. AUXOTROPHIEMARKER 37
11.1.5.2. MATING-TYPUS 38
11.1.5.3. BEKANNTE ERAD-SUBSTRATE 39
11.1.6 BIOINFORMATISCHE ANNOTATION UND EXPLORATIVE FAKTORANALYSE 40
11.1.6.1. DATENANNOTATION 41
11.1.6.2. SIGNALSEQUENZEN, TRANSMEMBRAN-DOMAENEN, UBIQUITINIERUNG 42
11.1.6.3. TRANSKRIPTIONELLE REGULATION 43
5
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I. EINLEITUNG
11.1.7 AUSSCHLUSS TRANSKRIPTIONELLER ZIELE MITTELS QPCR 47
11.1.8 BIOCHEMISCHE EVALUIERUNG MOEGLICHER E3-SUBSTRATE 48
11.1.8.1. DAS HRD1-SUBSTRAT ERG3 48
11.1.8.2. DAS HRD 1-SUBSTRAT YJR015W 50
11.1.8.3. DOA10-SUBSTRATE 51
11.2. AUTOPHAGIE 52
11.2.1 QUANTIFIZIERUNG DER VAKUOLAEREN PHOSPHATASE-AKTIVITAET 52
11.3. UBX7 - EIN CDC48-KOFAKTOR 56
11.3.1 BIOINFORMATISCHE CHARAKTERISIERUNG VON UBX7 56
11.3.1.1. PTMS IN UBX7 UND ERASIN 58
11.3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON UBX7 59
11.3.2.1. IDENTIFIZIERUNG EINER POST-TRANSLATIONALEN UBX7-MODIFIKATION
59
11.3.2.2. CHROMOSOMALE UND PLASMID-BASIERTE UBX7-EXPRESSION 64
11.3.2.3. DYNAMIK DER POST-TRANSLATIONALEN MODIFIKATION VON UBX7 67
11.3.2.4. AUSSCHLUSS EINER UBIQUITINIERUNG 75
11.3.2.5. LOKALISIERUNG DER PTM 76
11.3.2.6. NACHWEIS DER PHOSPHORYLIERUNG 77
11.3.2.7. POSITION DER PHOSPHORYLIERUNG 80
11.3.2.8. WEITERE AUF DIE PHOSPHORYLIERUNG EINFLUSSNEHMENDE FAKTOREN 82
11.3.2.9. MEMBRANASSOZIATION 88
11.3.2.10. AMPHIPATHISCHE HELIX 89
11.3.2.11. ERWEITERTE ANNOTATION DER UBX7-SEQUENZ 90
11.3.3 UBX6 - EIN ENG VERWANDTES PARALOG 92
11.3.3.1. SEQUENZHOMOLOGIE ZU UBX7 92
11.3.3.2. PHOSPHORYLIERUNG UND KO-IP 92
11.3.4 SYNTHETISCHE PHAENOTYPEN VON UBX7A UND SEINEN INTERAKTOREN 94
11.3.4.1. UBX7 & DFM1 & SHP1 94
11.3.4.2. UBX6 96
11.3.4.3. STARTCODON-MUTANTE UBX7A1 96
11.3.4.4. HERSTELLUNG DER UOEX7*-ALLEL-KOMBINATIONEN DURCH KREUZUNG 97
11.3.4.5. EXPRESSION DER UBX7-VARIANTEN A1, HLX*, S388A UND UBX* 98
11.3.4.6. WACHSTUMSANALYSE DER UBX7-VARIANTEN A1, HLX*, S388A UND UBX*
99
11.3.5 CHARAKTERISIERUNG DES UBX7-KOMPLEXES DURCH IMMUNPRAEZIPITATION 101
11.3.5.1. UBX7-TRUNKATIONSVARIANTEN 103
11.3.5.2. DER DFM1-UBX7-SHP1-CDC48 KOMPLEX 104
11.3.5.3. UBX7-MUTATIONEN 106
6
I. EINLEITUNG
III. DISKUSSION 107
111.1. PROTEOM-ANALYSE ERAD-DEFIZIENTER HEFESTAEMME 107
111.1.1 109
111.1.2 NEUE ERAD-SUBSTRATE 109
111.2. AUTOPHAGIE 114
111.3. DER CDC48-KOFAKTOR UBX7 116
111.3.1 DIE POST-TRANSLATIONALE MODIFIKATION VON UBX7 116
111.3.1.1. EFFEKTOREN DER UBX7-PHOSPHORYLIERUNG 117
111.3.1.2. DIE UBX7-PHOSPHORYLIERUNG IST ABHAENGIG VON DER
NAEHRSTOFFVERFUEGBARKEIT
118
111.3.1.3. PROTEINE DES UPS NEHMEN EINFLUSS AUF DIE PHOSPHORYLIERUNG VON
UBX7119
111.3.2 UBX7-MUTATIONSEFFEKTE MIT (PARTIELLEM) FUNKTIONSVERLUST 120
111.3.2.1. DAS IVBX7A./CAN/WX-TRANSKRIPTOM IST VON OFF-TARGET EFFEKTEN
BEEINFLUSST 120
111.3.2.2. UBX7A BEEINFLUSST DIE UBIQUITINIERUNG IN ENDOZYTOTISCHEN
PROZESSEN.... 121
111.3.2.3. UBX7A REVERTIERT DEN SHPL A-TS-PHAENOTYP 123
111.3.2.4. DIE ROLLE VON UBX7 IN DER PROTEINDEGRADIERUNG 125
IV. MATERIAL UND METHODEN 127
IV.
1. MATERIAL 127
IV.
1.1 BAKTERIEN UND HEFESTAEMME 127
IV.
1.2 PLASMIDE 130
IV.
1.3 OLIGONUKLEOTIDE 130
IV.
1.4 CHEMIKALIEN, PUFFERUND LOESUNGEN 132
IV.1.4.1. MASSENSPEKTROMETRIE 132
IV.1.4.2. MRNA-QUANTIFIZIERUNG 132
IV.2. METHODEN 132
IV.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 132
IV.2.1.1. KULTIVIERUNG VON HEFE (SACCHAROMYCES CEREVISIAE) 132
IV.2.1.2. BESTIMMUNG DER OPTISCHEN DICHTE VON HEFEKULTUREN 133
IV.2.1.3. HERSTELLUNG EINER DAUERKULTUR 133
IV.2.1.4. WACHSTUMSTEST AUF AGARPLATTEN 133
IV.2.1.5. HEFETRANSFORMATION MITTELS HITZESCHOCK 133
IV.2.1.6. VERPAARUNG, SPORULATION UND TETRADENDISSEKTION VON HEFEZELLEN
134
IV.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 134
IV.2.2.1. CHROMOSOMALE EPITOP-MARKIERUNG, DELETION UND INTEGRATION VON
GENEN IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE MITTELS PCR 134
IV.2.2.2. PRAEPARATION VON HEFE-GESAMTZELLEXTRAKTEN MITTELS MECHANISCHER
LYSE. 135
IV.2.2.3. ISOLIERUNG MEMBRAN-ASSOZIIERTER PROTEINE AUS HEFEZELLEN 135
7
I. EINLEITUNG
IV.2.2.4. PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS HEFEZELLEN 136
IV.2.2.5. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 136
IV.2.3 BIOCHEMISCHE METHODEN 137
IV.2.3.1. GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN 137
IV.2.3.2. MRNA-QUANTIFIZIERUNG 137
IV.2.3.3. GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 138
IV.2.3.4. IMMUNBLOT (WESTERN BLOT) 138
IV.2.3.5. COOMASSIE-FAERBUNG VON PROTEINEN IM SDS-GEL 138
IV.2.3.6. DEGLYKOSYLIERUNG VON PROTEINEN 139
IV.2.3.7. KO-IMMUNPRAEZIPITATION 139
IV.2.3.8. CYCLOHEXIMID-ABBAU-EXPERIMENT 140
IV.2.3.9. PULSE-CHASE-EXPERIMENT 140
IV.2.4 SILAC: PROTEOM-QUANTIFIZIERUNG DURCH MASSENSPEKTROMETRIE 141
IV.2.4.1. HERSTELLUNG ISOTOPISCH MARKIERBARER HEFESTAEMME 141
IV.2.4.2. AUFZUCHT DER HEFESTAEMME FUER SILAC 142
IV.2.4.3. LYSE, FRAKTIONIERUNG UND GELELEKTROPHORESE 142
IV.2.4.4. PROBENAUFBEREITUNG NACH DEM */M-GE/ -VERDAU-VERFAHREN 143
IV.2.4.5. CHROMATOGRAPHIE UND MASSENSPEKTROMETRIE 145
IV.2.4.6. QUANTIFIZIERUNG UND STATISTISCHE ANALYSE 145
IV.2.4.7. DATENANNOTATION 145
IV.2.4.8. VERGLEICH VON PROTEOM-WEITEN DATENSAETZEN 146
V. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 147
VI. REFERENZEN 149
PUBLIKATIONEN 157
SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 157
8
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