Die Bedeutung vom MIF und MIF-vermittelten Signalen für die Regulation der B-Lymphozyten-Rekrutierung:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2015
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| Beschreibung: | XI, 111 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
DANKSAGUNG
LITERATURANGABE I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS II
INHALTSVERZEICHNIS VI
1 EINLEITUNG
1.1 ATHEROSKLEROSE
1.1.1 PATHOGENESE DER ATHEROSKLEROSE
1.1.2 BEDEUTUNG DER CHEMOKINE FUER DIE ATHEROSKLEROSEENTWICKLUNG
1.1.3 BEDEUTUNG DER B-ZELLEN FUER DIE ATHEROSKLEROSE
1.2 LEUKOZYTENMIGRATION
1.2.1 INTRAZELLULAERE SIGNALWEITERLEITUNG
1.2.2 REZEPTORINTERNALISIERUNG UND DESENSITIVIERUNG 9
1.3 MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR 10
1.3.1 MIF-REZEPTOREN 11
1.3.1.1 CD74 11
1.3.1.2 CXCR2 12
1.3.1.1 CXCR4 13
1.3.2 BEDEUTUNG VON MIF FUER DIE ATHEROGENESE 13
1.3.3 EINFLUSS VON MIF AUF DIE ZELLMIGRATION 15
1.4 ZETA-CHAIN ASSOCIATEDPROTEIN KINASE 70 16
1.4.1 ZAP-70 ALS TEIL DES T-ZELL-REZEPTORS 16
1.4.2 BETEILIGUNG VON ZAP-70 AN DER MIGRATION VON T- UND B-ZELLEN 17
1.5 ZIELSETZUNG 18
2 ERGEBNISSE 20
2.1 MURINE B-LVMPHOZYTEN EXPRIMIEREN DIE MIF-REZEPTOREN CXCR4 UND
CD74 20
VII
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2 MIGRATIONSVERSUCHE 21
2.2.1 MIF BESITZT EINEN CHEMOTAKTISCHEN EINFLUSS AUF B-LYMPHOZYTEN 21
2.2.2 CXCR4 VERMITTELT DEN CHEMOTAKTISCHEN EINFLUSS VON MIF AUF B-ZELLEN
23
2.2.3 CD74 IST FUER DIE VERMITTLUNG DES CHEMOTAKTISCHEN EINFLUSSES VON
MIF AUF B-ZELLEN
VON BEDEUTUNG 25
23 MIF INDUZIERT DIE CALCIUMMOBILISIERUNG IN B-LYMPHOZYTEN 26
2.4 MIF-STIMULATION INDUZIERT DIE F-AKTIN-POLYMERISIERUNG IN B-ZELLEN 27
2.5 CHEMOKINABHAENGIGE PHOSPHORYLIERUNG DER ZETA-CHAIN ASSOCIATEDPROTEIN
KINASE 70 29
2.5.1 MIF UND CXCL12 INDUZIEREN DIE ZAP-70-PHOSPHORYLIERUNG IN
RAJI-ZELLEN 29
2.5.2 MIF UND CXCL12 INDUZIEREN DIE ZAP-70-PHOSPHORYLIERUNG IN PRIMAEREN
MURINEN
B-LYMPHOZYTEN 30
2.5.3 CD74, CXCR4, G,A -PROTEINE UND SRC-KINASEN VERMITTELN DIE
MIF-INDUZIERTE
ZAP-70-PHOSPHORYLIERUNG 31
2.6 BEDEUTUNG VON ZAP-70 FUER DIE CHEMOTAXIS VON B-LYMPHOZYTEN 33
2.6.1 DER ZAP-70-INHIBITOR PICEATANNOL INHIBIERT DIE CHEMOKIN-INDUZIERTE
ZAP-70-PHOSPHORYLIERUNG 33
2.6.2 PICEATANNOL INHIBIERT DIE MIF-INDUZIERTE B-ZELLMIGRATION 34
2.6.3 ZAP-70 IST FUER DIE MIF-INDUZIERTE MIGRATION VON ENTSCHEIDENDER
BEDEUTUNG 36
2.6.4 ZAP-70-DEFIZIENTE B-ZELLEN ZEIGEN KEINE MIGRATION GEGEN MIF ODER
CXCL12 38
2.7 IN VIVO HOMING-ASSAY VON B-LYMPHOZYTEN IN WILDTYP UND
MIF-DEFIZIENTEN
MAEUSEN 39
2.8 BEDEUTUNG VON INTRAZELLULAEREM MIF FUER DIE ZELLMIGRATION 41
2.8.1 MIF-DEFIZIENTE B-ZELLEN ZEIGEN KEINE MIGRATION GEGEN MIF ODER
CXCL13 41
2.8.2 MIF-DEFIZIENZ BEEINFLUSST DIE MIF- UND CXCL12-INDUZIERTE F-AKTIN-
POLYMERISIERUNG UND ZAP-70-PHOSPHORYLIERUNG 43
2.9 REGULATION DER MIF-REZEPTOREN AUF B-LYMPHOZYTEN UNTER
INFLAMMATORISCHEN
KONDITIONEN 45
2.9.1 LPS INDUZIERT EINE ERHOEHUNG DES CD74-PROTEINLEVELS UND DER CD74
ZELLOBERFLAECHENEXPRESSION AUF MURINEN B-LYMPHOZYTEN 45
2.9.2 LPS INDUZIERT EINE ERHOEHUNG DES CD74-PROTEINLEVELS UND DER CD74-
ZELLOBERFLAECHENEXPRESSION AUF RPMI-8226-B-ZELLEN 46
2.9.3 DIE LPS-INDUZIERTE CD74-UEBEREXPRESSION IST ZEIT- UND DOSISABHAENGIG
47
2.9.4 LPS REGULIERT DIE CD74-TRANSKRIPTION 49
2.9.5 SIGNALWEGANALYSE DER LPS-INDUZIERTEN CD74-UEBEREXPRESSION 50
VIII
INHALTSVERZEICHNIS
2.9.5.1 PI3K UND ERK1/2 HABEN KEINEN EINFLUSS AUF DIE LPS-INDUZIERTE
CD74-UEBEREXPRESSION 51
2.9.5.2 NF-KB VERMITTELT DIE LPS-INDUZIERTE CD74-UEBEREXPRESSION 53
2.9.5.3 DER NF-ICB-INHIBITORS BAY 11-7082 INHIBIERT DIE LPS-INDUZIERTE
CD74-TRANSKRIPTION 55
2.9.6 DIE CD74-UEBEREXPRESSION ERHOEHT DIE PROLIFERATION DER
RPMI-8226-ZELLEN 56
2.9.7 LPS INDUZIERT DIE SEKRETION VON MIF AUS RPMI-8226-ZELLEN 61
3 DISKUSSION 63
3.1 MIF INDUZIERT DIE MIGRATION VON B-LYMPHOZYTEN UNTER BETEILIGUNG DER
REZEPTOREN CD74 UND CXCR4 63
3.2 DIE AKTIVIERUNG VON ZAP-70 WIRD VON MIF KONTROLLIERT UND SPIELT EINE
ROLLE FUER DIE MIF-INDUZIERTE B-ZELLMIGRATION 65
3.3 EFFEKT VON MIF AUF DIE B-ZELLMIGRATION IN VIVO 67
3.3.1 MIF-DEFIZIENTE B-LYMPHOZYTEN ZEIGEN EIN VERAENDERTES
MIGRATIONSVERHALTEN 68
3.3.2 LPS FUHRT ZU EINER ERHOEHTEN CD74-EXPRESSION IN B-LYMPHOZYTEN 69
3.4 NF-KB
VERMITTELT DIE
LPS
-INDUZIERTE
CD74
-UEBEREXPRESSION
70
3.5 DIE LPS-INDUZIERTE CD74-UEBEREXPRESSION ERHOEHT DIE ZELLPROLIFERATION
71
3.6 DIE MIF-SEKRETION AUS RPMI-8226-ZEILEN WIRD DURCH
LPS-STIMULATION ERHOEHT 73
4 MATERIAL 76
4.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 76
4.2 ENZYME 77
4.3 PUFFER, LOESUNGEN UND MEDIEN 78
4.3.1 ALLGEMEINE PUFFER UND LOESUNGEN 78
4.3.2 PUFFER FIIR ZELLKULTURVERSUCHE 78
4.3.3 PUFFER FUER SDS-GELELEKTROPHORESE, WESTEM BLOT UND IMMUNDETEKTION
79
4.3.4 PUFFER FIIR HMIF-ELLSA 80
4.4 KITS 80
4.5 GERAETE 80
4.6 VERBRAUCHSMATERIALIEN 82
4.7 SOFTWARE 83
4.8 ANTIKOERPER 83
IX
INHALTSVERZEICHNIS
4.8.1 PRIMAERANTIKOERPER 83
4.8.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 84
4.9 PRIMER 84
4.10 SIRNAS 85
4.11 ZELLLINIEN 85
4.12 MAUSLINIEN 86
5 METHODEN 87
5.1 BIOCHEMISCHE METHODEN 87
5.1.1 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN 87
5.1.2 AUFTRENNUNG VON PROTEINEN MITTELS DISKONTINUIERLICHER SDS-PAGE 87
5.1.3 WESTERN BLOT 87
5.1.4 IMMUNDETEKTION 88
5.1.5 PROTEIN-BESTIMMUNG NACH BRADFORD 88
5.1.6 BESTIMMUNG DER PROTEIN-OBERFLAECHENEXPRESSION 89
5.1.7 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FUER HUMANES MIF 89
5.2 QUANTITATIVE ECHTZEIT-POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-QPCR) 90
5.2.1 RNA-ISOIATION 90
5.2.2 CDNA-SYNTHESE 90
5.2.3 RT-QPCR 90
53 ZELLKULTURTECHNIK 91
5.3.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 91
5.3.2 KRYOKONSERVIERUNG 92
5.3.3 ZELLZAHLBESTIMMUNG 92
5.3.4 TRANSFEKTION VON RAMOS-ZELLEN MIT SIRNA 92
5.3.5 ISOLIERUNG DER PRIMAERZELLEN AUS DER MILZ 93
5.3.6 ISOLIERUNG DER B-LYMPHOZYTEN 93
5.3.7 STIMULATION VON ZELLEN MIT CHEMOKINEN ODER LPS 94
5.4 FUNKTIONSANALYTISCHE ASSAYS 94
5.4.1 IN VITRO CHEMOTAXIS-ASSAY 94
5.4.2 CALCIUMMOBILISATIONSMESSUNGEN 94
5.4.3 F-AKTIN-POLYMERISIERUNG 95
5.4.4 HOMING-VERSUCHE 95
5.4.5 ZELLZYKLUSANALYSEN 96
5.4.6 PROLIFERATIONSASSAY 96
5.4.7 CFSE-BASIERTE ZELLTEILUNGSANALYSE 97
X
INHALTSVERZEICHNIS
5.5 STATISTIK 98
6 ZUSAMMENFASSUNG 99
7
LITERATUR
102
XI
|
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Inhaltsverzeichnis