Identifizierung von molekularen Gating-Bewegungen und Interaktionspartnern des P2X7-Rezeptors:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2015
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|---|---|
| adam_text | EINLEITUNG 1
1.1 LIGANDENGESTEUERTE IORTENKANAELE 1
| 1.2 ATP ALS NEUROTRANSMITTER 6
1.3 PURINERGE REZEPTOREN 6
1.3.1 P2X-REZEPTOREN 7
* 1.3.2 DER P2X7-REZEPTOR 13
1.3.2.1 TOPOLOGIE UND FUNKTIONEN DES P2X7-REZEPTORS 15
1.3.2.2 DER P2X7-REZEPTOR ALS INTERAKTIONSPARTNER 21
!
| 1.4 AMILORID-SENSITIVE IONENKANAELE: ASIC 23
I 1.5 KALZIUM-AKTIVIERTE CHLORIDKANAELE: ANOCTAMINE 26
. J ZIELSETZUNG 30
MATERIAL UND METHODEN 32
I
3.1 MATERIAL 32
| 3.1.1 CHEMIKALIEN 32
J 3.1.2 DETERGENZIEN 32
3.1.3 OLIGONUKLEOTIDE 32
3.1.4 ENZYME 32
3.1.5 WASSER 32
3.1.6 KITS 33
3.2 METHODEN 34
I 3.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 34
3.2.1.1 VERWENDETE PLASMIDE UND VEKTOREN 34
I
| 3.2.1.2 TRANSFORMATION UND PLASMID-ISOLATION 35
3.2.1.3 GERICHTETE MUTAGENESE 35
, 3.2.1.4 PCR-AMPLIFIKATION UND LIGATION ZUR SUBKLONIERUNG 37
3.2.1.5 GATEWAY@-KLONIERUNG 39
; 3.2.1.6 SEQUENZIERUNG 39
3.2.1.7 IN-VITRO-CRNA-SYNTHESE 40
3.2.2 XENOPUS LAEVIS-OOZYTEN UND AMBYSTOMA MEXICANUM-OOZYTEN ALS EXPRES
SIONSSYSTEM 40
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3.2.2.1 HERKUNFT UND HALTUNG DER TIERE 41
3.2.2.2 PRAEPARATION DES OVARS UND AUFREINIGUNG DER OOZYTEN 41
3.2.2.3 CRNA-INJEKTION ZUR PROTEINEXPRESSION 42
3.2.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 43
3.2.3.1 METABOLISCHE MARKIERUNG DER PROTEINE MIT [
35
S]-METHIONIN ... 43
3.2.3.2 FLUORESZENZMARKIERUNG MEMBRANINTEGRIERTER PROTEINE 43
3.2.3.3 ATP-STIMULATION MEMBRANINTEGRIERTER REZEPTOREN 44
3.2.3.4 QUERVERNETZUNG MEMBRANINTEGRIERTER PROTEINE UNTER
VERWENDUNG CHEMISCHER CROSSLINKER 44
3.2.3.5 AUFREINIGUNG UND ISOLATION VON PROTEINEN 45
3.2.3.5.1 NICKEL-CHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 45
3.2.3.5.2 STREP-TACTIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 46
3.2.3.5.3 IMMUNPRAEZIPITATION 46
3.2.3.6 ENZYMATISCHE DEGLYKOSYLIERUNG VON PROTEINEN 47
3.2.4 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 48
3.2.4.1 BLAU-NATIVE PAGE 48
3.2.4.2 REDUZIERENDE UND NICHT-REDUZIERENDE SDS-PAGE 49
3.2.5 DETEKTION DER AUFGEREINIGTEN PROTEINE 51
3.2.5.1 FLUORESZENZSCAN 51
3.2.5.2 PHOSPHORLMAGING 52
3.2.6 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE FUNKTIONSMESSUNG 53
3.2.7 STATISTISCHE DATENANALYSE 53
4 ERGEBNISSE 55
4.1 UNTERSUCHUNG MOLEKULARER GATING-BEWEGUNGEN INNERHALB DER ZWEITEN
TRANSMEM
BRANDOMAENE DES HP2X7-REZEPTORS 55
4.1.1 BIOCHEMISCHER NACHWEIS DER EXPRESSION DER TM2-CYSTEIN-MUTANTEN ...
55
4.1.2 ERMITTLUNG DER ZUGAENGLICHKEIT DER EINGEFUEGTEN CYSTEINE INNERHALB
DER
TM2 FUER EXTRAZELLULAER APPLIZIERTES MALEIMID 59
4.2 ANALYSE MOEGLICHER INTERAKTIONEN DES P2X7R MIT REZEPTOREN DER
P2X-FAMILIE . . 70
4.2.1 INTERAKTION VON P2X1- UND P2X7-REZEPTOREN 71
4.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER INTERAKTION VON P2X4- UND P2X7-REZEPTOREN
... 76
4.2.2.1 SDS-PAGE-ANALYSE DER KO-EXPRIMIERTEN HP2X4R UND HP2X7R 77
4.2.2.2 BN-PAGE-ANALYSE DER KO-EXPRIMIERTEN HP2X4R UND HP2X7R
ZUR DIFFERENZIERUNG VON INTER- UND INTRA-SUBTYPISCHEN INTERAKTIONEN 86
4.3 IDENTIFIZIERUNG WEITERER PROTEINOGENER INTERAKTIONSPARTNER DES
P2X7-REZEPTORS 99
4.3.1 AMILORID-SENSITIVE IONENKANAELE: ASIC 99
4.3.1.1 SDS-PAGE-ANALYSE ZUM NACHWEIS DER EXPRESSION DER HASIC . 100
4.3.1.2 BN-PAGE-ANALYSE DER HASIC-SUBTYPEN ZUM BIOCHEMISCHEN
NACHWEIS DES OLIGOMERISIERUNGSZUSTANDS 109
4.3.1.3 SCREENING DER INTERAKTION ZWISCHEN VERSCHIEDENEN ASIC- UND
P2X-SUBTYPEN 116
4.3.2 KALZIUM-AKTIVIERTE CHLORID-KANAELE: ANOCTAMINE 133
4.3.2.1 P2X7R UND P2Y1R INTERAGIEREN FUNKTIONELL MIT ANOL 133
4.3.2.1.1 BIOCHEMISCHE ANALYSE EINER STABILEN PROTEIN-PROTEIN-
INTERAKTION VON 134
4.3.2.1.2 BIOCHEMISCHE ANALYSE EINER STABILEN PROTEIN-PROTEIN-
INTERAKTION VON 139
4.3.2.2 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN P2X7R UND ANO6 .... 143
4.4 CHARAKTERISIERUNG ESSENTIELL AN DER BINDUNG DES ANTI-HP2X7R- MAB
BETEILIGTER
AMINOSAEUREN DER EKTODOMAENE DES HP2X7R 153
5 DISKUSSION 161
5.1 CHARAKTERISIERUNG MOLEKULARER GATING-BEWEGUNGEN DES HP2X7-REZEPTORS
.... 161
5.2 NACHWEIS DER INTERAKTION VON P2X7R UND P2X1R 169
5.3 NACHWEIS DER BILDUNG HETEROTRIMERER HP2X4I/72-REZEPTOREN 170
5.4 NACHWEIS WEITERER INTERAKTIONSPARTNER DES HP2X7R 173
5.4.1 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ASIC-SUBTYPEN 175
5.4.2 P2X7R INTERAGIERT MIT ASIC3 178
5.4.3 INTERAKTION VON P2-REZEPTOREN UND ANOCTAMINEN 181
5.4.3.1 P2X7R INTERAGIERT FUNKTIONELL MIT ANOCTAMIN 1 181
5.4.3.2 P2Y1R INTERAGIERT FUNKTIONELL MIT ANOCTAMIN 1 184
5.4.3.3 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DES ANOCTAMIN 6 185
5.4.3.4 P2X7R INTERAGIERT NICHT MIT ANOCTAMIN 6 186
5.5 E115 UND 1214 DES HP2X7R SIND ESSENTIELL AN DER BINDUNG DES
ANTI-HP2X7R-MAB
BETEILIGT 187
6 ZUSAMMENFASSUNG 189
7 LITERATUR 190
8 ANHANG 214
8.1 VERWENDETE CDNA-KONSTRUKTE 214
8.2 REFERENZSEQUENZEN DER VERWENDETEN REZEPTORTYPEN 218
8.3 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 219
9 VEROEFFENTLICHUNGEN 222
10 EIGENSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 224
11 OANKSAGUNG 225
12 LEBENSLAUF 226
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