Entwicklung eines Zellkultur-basierten Testverfahrens zur Evaluierung potentieller Wirkstoffe gegen Cryptosporidium parvum:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch und Buch Verl.
2015
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | kostenfrei Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Nebentitel: Development of a cell culture based assay for the evaluation of putative compounds against Cryptosporidium parvum |
| Beschreibung: | III, 152 S. Ill., graph. Darst. |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURUEBERSICHT 3
2.1 CRYPTOSPORIDIUM PARVUM 3
2.1.1 ZUR GESCHICHTE DES ERREGERS 3
2.1.2 TAXONOMIE UND WIRTSSPEKTRUM 4
2.1.3 ENTWICKLUNGSZYKLUS UND MORPHOLOGIE 6
2.1.4 EPIDEMIOLOGIE 9
2.1.5 IN VITRO KULTIVIERUNG 12
2.1.5.1 ENTERALE ZELLLINIEN 13
2.1.5.2 ZELLLINIEN NICHT-ENTERALEN URSPRUNGS 15
2.1.5.3 ZELLFREIE KULTIVIERUNG 19
2.1.5.4 MEDIUMZUSAETZE 21
2.2 CRYPTOSPORIDIOSE 23
2.2.1 KLINIK DER HUMANEN CRYPTOSPORIDIOSE 23
2.2.2 KLINIK DER BOVINEN CRYPTOSPORIDIOSE 24
2.2.3 PATHOLOGISCHE BEFUNDE UND PATHOPHYSIOLOGIE 25
2.2.4 CHEMOTHERAPEUTISCHE ANSAETZE ZUR BEHANDLUNG DER CRYPTOSPORIDIOSE 26
3 MATERIAL UND METHODEN 33
3.1 MATERIALIEN 33
3.1.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 33
3.1.2 GERAETE 33
3.1.3 REAGENZIEN 36
3.1.4 PUFFER UND LOESUNGEN 38
3.1.5 MEDIEN, NAEHRBOEDEN UND MIKROORGANISMEN 38
3.1.6 ENZYME 39
3.1.7 REAKTIONSKITS 39
3.1.8 WIRKSTOFFE 40
3.1.8.1 WIRKSTOFFFORMULIERUNG 41
3.1.9 SOFTWARE 41
3.1.10 OOCYSTEN 42
3.1.11 ZELLEN 42
3.2 METHODEN 43
3.2.1 ZELLKULTUR 43
3.2.2 ZELLINFEKTION 44
3.2.2.1 VORVERSUCHE ZUR OPTIMIERUNG DER IN VITRV KULTIVIERUNG VON C.
PARVUM 45
3.2.2.1.1 ERUIERUNG DES OPTIMALEN ANALYSEZEITPUNKTES FUER DIE DNA
ISOLATION 45
I
HTTP://D-NB.INFO/1077263147
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.1.2 OPTIMIERUNG DER OOCYSTERIKONZENTRATION 45
3.2.2.1.3 EINFUEHRUNG EINES ZENTRIFUGATIONSSCHRITTES 46
3.2.3 UEBERPRUEFUNG VON SUBSTANZEN AUF ANTICRYPTOSPORIDIALE WIRKSAMKEIT 46
3.2.3.1 OPTIMIERUNG DER DMSO-KONZENTRATION 47
3.3 DNA-ISOLATION 48
3.3.1 DNA-ISOLATION MIT DEM NUCLEOSPIN 8 TISSUE KIT (MACHERY-NAGEL) 48
3.3.2 DNA-ISOLATION MIT DEM MAXWELL 16 LEV BLOOD DNA KIT (PROMEGA) 48
3.3.3 DNA-ISOLATION AUS OOCYSTEN 49
3.3.4 QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 49
3.4 PCR 50
3.4.1 KONVENTIONELLE PCR 50
3.4.1.1 OPTIMIERUNG KONVENTIONELLE PCR 51
3.4.2 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (RELATIVE QUANTIFIZIERUNG) 52
3.4.2.1 HERSTELLUNG DER STANDARDS 54
3.4.2.2 OPTIMIERUNG DER QPCR 54
3.4.3 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG) 54
3.4.3.1 HERSTELLUNG DER STANDARDS 56
3.4.3.1.1 HERSTELLUNG DES ORIGINAEREN CRYPTOSPORIDIALEN STANDARDS 57
3.4.3.1.2 HERSTELLUNG DES IN VITRO MUTAGENISIERTEN CRYPTOSPORIDIALEN
STANDARDS ..57
3.5 AGAROSE-GELELEKTOPHORESE 58
3.6 DNA-EXTRAHIERUNG AUS EINEM AGAROSEGEL 58
3.7 KLONIERUNG MIT DEM TOPO TA CLONING KIT FOR SEQUENCING (INVITROGEN)
59
3.7.1 LIGATION 59
3.7.2 TRANSFORMATION IN ONE SHOT TOP10 ZELLEN (INVITROGEN) 59
3.7.3 BAKTERIENKULTUREN 60
3.7.4 ANTIBIOTIKAZUSAETZE 60
3.7.5 GLYCEROLSTOCKS 60
3.8 PLASMIDPRAEPARATION 60
3.8.1 MINIPREP 60
3.8.2 MIDIPREP 61
3.8.3 KONTROLLE DES INSERTS 61
3.8.4 SEQUENZANALYSE 61
3.9 VIABILTITAETS UND- ZYTOTOXIZITAETSASSAYS 62
3.9.1 LACTATDEHYDOGENASE-ASSAY 62
3.9.1.1 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN ZELLKONZENTRATION 64
3.9.2 WST-1-ASSAY 64
4 ERGEBNISSE 67
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.1 VORVERSUCHE: OPTIMIERUNG DER (Q)PCR UND DER IN VITRO KULTIVIERUNG
VON C. PARVUM.67
4.1.1 ERUIERUNG DES OPTIMALEN ANALYSEZEITPUNKTES FUER DIE DNA-ISOLATION
67
4.1.2 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (RELATIVE QUANTIFIZIERUNG) 68
4.1.3 OOCYSTENKONZENTRATION 69
4.1.4 EINFUEHRUNG EINES ZENTRIFUGATIONSSCHRITTES 71
4.2 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG) 72
4.3 UEBERPRUEFUNG VON SUBSTANZEN AUF ANTICRYPTOSPORIDIALE WIRKSAMKEIT 74
4.3.1 POSITIV UND- NEGATIVKONTROLLEN 74
4.3.1.1 POSITIVKONTROLLEN: PAROMOMYCIN UND NITAZOXANID 74
4.3.1.2 NEGATIVKONTROLLEN 76
4.3.1.2.1 OPTIMIERUNG DER DMSO-KONZENTRATION 76
4.3.2 WIRKSTOFFUEBERPRUEFUNG IN 96-LOCH GEWEBEKULTURSCHALEN 78
4.3.3 WIRKSTOFFUEBERPRUEFUNG IN 48-LOCH GEWEBEKULTURSCHALEN 80
4.3.4 BAY-AF76184 UND BAY-AB24992 83
4.3.4.1 LACTATDEHYDROGENASE-ASSAY 87
4.3.4.1.1 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN ZELLKONZENTRATION 87
4.3.4.1.2 ZYTOTOXIZITAET DER WIRKSTOFFE 89
4.3.4.2 WST-1-ASSAY 91
5 DISKUSSION 95
5.1 OPTIMIERUNG DER (Q)PCR UND DER IN VITRO KULTIVIERUNG VON C. PARVUM
95
5.2 UEBERPRUEFUNG VON SUBSTANZEN AUF ANTICRYPTOSPORIDIALE WIRKSAMKEIT 102
5.2.1 NEGATIVKONTROLLEN 102
5.2.2 POSITIVKONTROLLEN 103
5.2.3 WIRKSTOFFE 104
5.3 BAY-AF76184 UND BAY-AB24992 106
5.4 SCHLUSSFOLGERUNG 112
6 ZUSAMMENFASSUNG 114
7 SUMMARY 116
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 118
9 LITERATURVERZEICHNIS 121
10 ANHANG 137
11 PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 150
12 DANKSAGUNG 151
13 SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 152
III
|
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| title_full | Entwicklung eines Zellkultur-basierten Testverfahrens zur Evaluierung potentieller Wirkstoffe gegen Cryptosporidium parvum vorgelegt von Maja Schupfner |
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