Charakterisierung des Kapsid-assoziierten Proteins pUL77 des Humanen Cytomegalievirus:
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2015
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INHALT
1 EINLEITUNG 1
1.1 HERPESVIREN-TAXONOMIE UND HUMANPATHOGENE VERTRETER 1
1.2 DAS HUMANPATHOGENE CYTOMEGAUEEVIRUS-HCMV 2
1.2.1 HISTORISCHE ASPEKTE 2
1.2.2 KLINISCHE ASPEKTE 3
1.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE ASPEKTE
5
1.3 PUL77 VON HCMV 11
1.4 NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHER PROTEINTRANSPORT 11
1.4.1 NUKLEARE LOKALISATIONSSIGNALE 11
1.4.2 KERNTRANSPORTMECHANISMEN 12
1
.5
D
AS
COILED-COIL-MOTW 13
2 ZIELSTELLUNG 14
3 MATERIAL 15
3.1 CHEMIKALIEN 15
3.2 GRUND- UND ZUSATZSTOFFE FUER KULTURMEDIEN 16
3.3 ANTIBIOTIKA 16
3.4 ENZYME, KITS UND MARKER 16
3.5 VERBRAUCHSMATERIALJEN 17
3.6 GERAETE 17
3.7 SOFTWARE FUER DIE INSILICO-ANALYSE VON
PROTEINEN 18
3.8 ANTIKOERPER 19
3.9 RADIOAKTIVE SUBSTANZEN 19
3.10 ZELLUNIEN, BAKTERIEN- UND VIRUSSTAEMME 20
3.10.1 BAKTERIENSTAEMME 20
3.10.2 VIRUSSTAEMME 20
3.10.3 ZELLLINIEN 20
3.11 OUGONUKLEOTIDE 21
3.12
P
LASMIDE 22
4 METHODEN 24
4.1 EUKARYOTISCHE ZELLKULTUR 24
4.1.1 KULTIVIERUNG 24
4.1.2 ANZUCHT DES LABORSTAMMS HCMVAD169 24
4.1.3 TITERBESTIMMUNG DER VIRUSSUSPENSION 24
4.1.4 EXPERIMENTELLE VIRUSINFEKTION 25
4.1.5 GEWINNUNG VON ZELLEXTRAKTEN 25
4.1.6 GEWINNUNG VON KERNEXTRAKTEN 26
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4.1.7 TRANSIENTE TRANSFEKTION 26
4
.2
P
ROKARYOTISCHE
Z
ELLKULTUR
27
4.2.1 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA 27
4.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 28
4.2.3 BAKTERIELLE UEBEREXPRESSION VON GST
(GLUTATHION-S-TRANSFERASE)-FUSIONSPROTEINEN 29
4.3 ARBEITEN MIT DNA 30
4.3.1 DNA-VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 30
4.3.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 30
4.3.3 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 30
4.3.4 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 31
4.3.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 33
4.3.6 ELUIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 34
4.3.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DOPPELSTRAENGIGER DNA 34
4.3.8 DNA-SEQUENZIERUNG 34
4.4 ARBEITEN MIT PROTEINEN 34
4.4.1 SDS-PAGE 34
4.4.2 COOMASSIEFAERBUNG 35
4.4.3 WESTERN BLOT 36
4.4.4 AUTORADIOGRAFIE 37
4.4.5 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 37
4.4.6 EXPRESSION VON PROTEINEN DURCH IN VITRO-TRANSLATION 38
4.4.7 AFFMITAETSCHROMATOGRAFIE 38
4.4.8 IN VITRO-PROTEININTERAKTIONS-UNTERSUCHUNGEN 39
4.5
K
LONIERUNGEN
41
4.5.1 KLONIERUNG DER PHM829-KONSTRUKTE 41
4.5.2 KLONIERUNG VON UL77-VARIANTEN IN PCDNA3.1HISC_UL77 42
4.5.3 KLONIERUNG DER UL93-KONSTRUKTE 43
4.5.4 VERIFIZIERUNG DER VERAENDERTEN KONSTRUKTE 44
5 ERGEBNISSE 45
5.1 AMINOSAEURESEQUENZVERGLEICH DER UL25-HOMOLOGE VON
HCMV, HSV-1 UND PRV 45
5.2 EXPRESSIONSKINETIK UND SUBZELLULAERE VERTEILUNG VON PUL77 IN
INFIZIERTEN ZELLEN 47
5.2.1 EXPRESSIONSANALYSE VON PU77 47
5.2.2 SUBZELLULAERE VERTEILUNG VON PUL77 48
5.2.3 EXPRESSION VON PUL77 UNTER EINFLUSS VON PHOSPHONOESSIGSAEURE 49
5.2.4 KERNLOKALISATION VON PUL77 50
5.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR KERNLOKALISATION VON PUL77 51
5.3.1 IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSE VON TRANSIENT TRANSFIZIERTEN ZELLEN 51
5.3.2 IN SILICO-UNTERSUCHUNG VON PUL77 ZUR
KEMLOKALISATIONSSIGNAL-IDENTIFIZIERUNG 53
5.3.3 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN POTENTIELLER
NLS-SEQUENZEN IN DER
REPORTERPROTEINCHIMAERE PHM829 54
5.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR DIMERISIERUNG VON PUL77 56
5.4.1 IN SILICO-UNTERSUCHUNGEN VON PUL77 ZUM DIMERBILDUNGSPOTENTIAL 56
5.4.2 UNTERSUCHUNGEN MITTELS GLUTARALDEHYD-QUERVERNETZUNG 57
5.4.3 UNTERSUCHUNGEN MITTELS GLUTATHION-S-TRANSFERASE-PULLDOWNASSAY 58
5.4.4 UNTERSUCHUNGEN MITTELS CO-IMMUNPRAEZIPITATION 60
5.5 UNTERSUCHUNGEN ZU DSDNA-BINDEEIGENSCHAFTEN VON PUL77 61
5.5.1 DSDNA-BINDEEIGENSCHAFTEN VON IN VITRO-TRANSLATIERTEM PUL77 61
5.5.2 UNTERSUCHUNGEN MIT KERNEXTRAKTEN INFIZIERTER ZELLEN 62
5.5.3 UNTERSUCHUNGEN MIT EXTRAKTEN TRANSIENT TRANSFIZIERTER
HEK293T-ZELLEN 63
5.6 INTERAKTION VON PUL77 MIT VIRALEN PROTEINEN 66
5.6.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR INTERAKTION VON PUL77 MIT DER GROSSEN
TERMINASE-UNTEREINHEIT PUL56 67
5.6.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR INTERAKTION VON PUL77 MIT DER KLEINEN
TERMINASE-UNTEREINHEIT PUL89 70
5.6.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR INTERAKTION VON PUL77 MIT PUL93 73
6 DISKUSSION 79
6.1 EXPRESSIONSKINETIK UND SUBZELLULAERE LOKALISATION VON PUL77 80
6.2 KERNLOKAUSATION VON PUL77 81
6.3 DIMERISIERUNG UND DNA-BINDUNG VON PUL77 84
6.4 INTERAKTION VON PUL77 MIT VIRALEN PROTEINEN 87
6.5 MODELL DER DNA-VERPACKUNG MIT PUL77 89
7 ZUSAMMENFASSUNG 93
8 LITERATURVERZEICHNIS 95
9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 114
10 ANHANG I
10.1 AKADEMISCHER LEBENSLAUF I
10.2
V
EROEFFENTUCHUNGEN
IV
10
.3
D
ANKSAGUNGEN
VI
10.4 SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG VII |
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