Optimierung der Immunantwort gegen Hybridprotein 14/30 zur Verhinderung einer Kolonisation durch Mycoplasma pneumoniae im Infektionsmodell:
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS I
1 EINLEITUNG 1
1.1 ALLGEMEINE CHARAKTERISTIK DER MYKOPLASMEN 1
1.2 DER ERREGER MYCOPLASMA PNEUMONIAE 2
1.3 DAS TERMINAL/ATTACHMENT-ORGANELL VON M. PNEUMONIAE 5
1.3.1 ULTRASTRUKTUR 5
1.3.2 CYTOADHAERENZ 6
1.3.2.1 PI-PROTEIN 8
1.3.2.2 P30-PROTEIN 12
1.3.2.3 ADHAERENZ-ASSOZIIERTE PROTEINE 13
1.3.2.4 AKZESSORISCHE PROTEINE 14
1.3.3 GLEITBEWEGUNG 15
1.4 VAKZINIERUNGSVERSUCHE GEGEN M. PNEUMONIAE 16
1.4.1 ERSTE ANSAETZE DER IMPFSTOFFENTWICKLUNG 17
1.4.2 NEUERE ANSAETZE DER IMPFSTOFFENTWICKLUNG 18
1.5 IMMUNISIERUNGSSTRATEGIEN 18
1.6 CHITOSAN ALS VERPACKUNGSSYSTEM UND ADJUVANS FUER IMPFSTOFFE 20
1.7 ZIELSTELLUNG 21
2 MATERIAL UND METHODEN 23
2.1 MATERIAL 23
2.1.1 PUFFER UND LOESUNGEN 23
2.1.2 BAKTERIENSTAEMME 24
A
HTTP://D-NB.INFO/1067933123
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.3 NAEHRMEDIEN 24
2.1.4 ZELLLINIEN UND ZELLKULTURMEDIEN 25
2.1.5 OLIGONUKLEOTID-PRIMER UND SONDEN 25
2.1.6 ANTIKOERPER 25
2.1.7 CHEMIKALIEN, NAEHRMEDIEN, ENZYME, GROESSENSTANDARDS 26
2.1.8 KITS 28
2.1.9 VERBRAUCHSMATERIAL 28
2.1.10 GERAETE 29
2.1.11 COMPUTERPROGRAMME UND INTERNETPROGRAMME 31
2.2 METHODEN 31
2.2.1 KULTIVIERUNG VON M. PNEUMONIAE 31
2.2.2 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA COLI 32
2.2.3 KULTIVIERUNG DER HUMANEN ZELLLINIE HELA 32
2.2.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 32
2.2.4.1 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA 32
2.2.4.2 KONVENTIONELLE POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 32
2.2.4.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 33
2.2.4.4 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN 33
2.2.4.5 LIGATIONSUNABHAENGIGE KLONIERUNG (LIC) 33
2.2.4.6 TRANSFORMATION E. COLI NOVA BLUE 34
2.2.4.7 KOLONIE-SCREENING 34
2.2.4.8 DNA-SEQUENZIERUNG 34
2.2.4.9 PLASMID-DNA-PRAEPARATION 35
B
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.4.10 TRANSFORMATION VON E. COLI BL21(DE3) 35
2.2.4.11 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QRT-PCR) 35
2.2.4.11.1 ABSOLUTE QUANTIFIZIERUNG 35
2.2.4.11.1.1 ALLGEMEINE DURCHFUEHRUNG 36
2.2.4.11.2 RELATIVE QUANTIFIZIERUNG 36
2.2.4.11.2.1 RNA-STABILISIERUNG 37
2.2.4.11.2.2 RNA-ISOLIERUNG 37
2.2.4.11.2.3 DNASE-BEHANDLUNG 37
2.2.4.11.2.4 CDNA-SYNTHESE 37
2.2.4.11.2.5 ALLGEMEINE DURCHFUEHRUNG 37
2.2.4.11.2.6 REAL-TIME PCR-EFFIZIENZBERECHNUNG 38
2.2.4.11.2.7 BERECHNUNG DER RELATIVEN GENEXPRESSION 39
2.2.5 PROTEIN- UND IMMUNCHEMISCHE METHODEN 40
2.2.5.1 HETEROLOGE GENEXPRESSION UND ISOLATION VON REKOMBINANTEN
PROTEINEN 40
2.2.5.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 40
2.2.5.3 DIALYSE DER REKOMBINANTEN PROTEINE 41
2.2.5.4 GEWINNUNG VON M. PNEUMONIAE-GESAMTANTIGEN 41
2.2.5.5 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 41
2.2.5.6 COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG 41
2.2.5.7 WESTERN BLOT 41
2.2.5.8 IMMUNOBLOT 42
2.2.5.9 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 42
2.2.5.10 BINDUNGSFAEHIGKEIT REKOMBINANTER PROTEINE AN HELA-ZELLEN 43
C
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.5.10.1 ELISA-BASIERTER ASSAY 43
2.2.5.10.1 WESTERN BLOT BASIERTER ASSAY 44
2.2.5.11 IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST 44
2.2.6 ZEITABHAENGIGE ANALYSE DER GENEXPRESSION VERSCHIEDENER ADHAESINE UND
ADHAERENZ-ASSOZIIERTER PROTEINE VON M. PNEUMONIAE NACH KONTAKT MIT HELA-
ZELLEN 45
2.2.7 TIEREXPERIMENTELLE ARBEITEN 46
2.2.7.1 IMMUNISIERUNGSWEGE 46
2.2.7.1.1 SUBCUTANE IMMUNISIERUNG 46
2.2.7.1.2 INTRANASALE IMMUNISIERUNG 46
2.2.7.2 KOPPLUNG VON HP14/30 AN CHITOSAN (2-KOMPONENTENKOMPLEX) 47
2.2.7.2.1 STATISCHE LIBERATION DER CHIMAERE AUS DEM 2-KOMPONENTENKOMPLEX
47
2.2.7.3 VERSUCHSTIERBEPROBUNG 48
2.2.7.3.1 RACHENABSTRICH 48
2.2.7.3.2 NASALSPUELUNG 48
2.2.7.3.3 SERUMGEWINNUNG 49
2.2.7.3.4 BRONCHOALVEOLAERE-LAVAGE (BAL) 49
2.2.7.3.5 ORGANENTNAHME 49
2.2.7.4 BESTIMMUNG DER COLONY FORMING UNITS (CFU/ML) NACH EINER
INFEKTION DER
VERSUCHSTIERE MIT M. PNEUMONIAE 49
2.2.7.5 UNTERSUCHUNG DER IMMUNANTWORT UND KOLONISATION NACH EINMALIGER
INTRANSASALER INFEKTION VON MEERSCHWEINCHEN MIT M. PNEUMONIAE 50
2.2.7.6 IMMUNISIERUNGSEXPERIMENTE MIT HP 14/30 IM TIERMODELL
MEERSCHWEINCHEN51
2.2.7.6.1 VORVERSUCH ZUR ERMITTLUNG DER ANTIGENMENGE FUER EINE
INTRANASALE
IMMUNISIERUNG BEIM MEERSCHWEINCHEN 51
D
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.7.6.2 HAUPTVERSUCH 1: EINFLUSS DER ANTIGENFORMULIERUNG UND DES
IMMUNISIERUNGSWEGES AUF DIE HUMORALE IMMUNANTWORT 52
2.2.7.6.3 HAUPTVERSUCH 2: AUSWIRKUNG DER ANZAHL I.N.
BOOSTER-IMMUNISIERUNGEN
AUF DIE IMMUNANTWORT UND DEN VERLAUF DER IMMUNANTWORT IM
LANGZEITVERSUCH 52
2.2.7.7 HAUPTVERSUCH 3: UNTERSUCHUNG DER LUNGENKOLONISATION NACH
IMMUNISIERUNG
DER TIERE UND INFEKTION MIT M. PNEUMONIAE 53
ERGEBNISSE 55
3.1 UNTERSUCHUNG DER IMMUNANTWORT NACH EINER INTRANASALEN INFEKTION VON
MEERSCHWEINCHEN MIT M. PNEUMONIAE-STAMM ML29 55
3.1.1 HUMORALE IMMUNANTWORT GEGEN M. PNEUMONIAE NACH EINER INTRANASALEN
INFEKTION
55
3.1.1.1 GESAMT-IG IM SERUM 55
3.1.1.2 IGG IM SERUM 58
3.1.1.3 IGM IM SERUM 60
3.1.1.4 IGA IM SERUM 63
3.1.1.5 IGA IN DER BAL 65
3.1.2 HUMORALE IMMUNANTWORT NACH EINER INTRANASALEN INFEKTION MIT M.
PNEUMONIAE
GEGEN DEN RP14-PROTEINBEREICH VON PI UND RP30, DEN EINZELBESTANDTEILEN
VON
HP 14/30 : 66
3.1.2.1 QUALITATIVE ANALYSE (SERUM, BAL) DER GRUPPEN A BIS D IM
IMMUNOBLOT
GEGEN DIE SPEZIFISCHEN ANTIGENE RPH, RP30 UND HP 14/30 67
3.1.2.2 QUANTITATIVE ANALYSE DES SERUMS UND DER BAL VON TIER 1 DER
GRUPPEN A BIS
D IM ELISA GEGEN DIE ANTIGENE RP14, RP30 UND HP 14/30 69
3.1.3 FACS-BASIERTER IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST DER SEREN AUS DEN
GRUPPEN A BIS D.
71
E
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.4 REDUKTION DER CFU UND GENOMKOPIEN VON M. PNEUMONIAE IM
RESPIRATIONSTRAKT
UEBER 21 TAGE NACH EINER INTRANASALEN INFEKTION 72
3.2 UNTERSUCHUNG VON MONOSPEZIFISCHEN ANTISEREN GEGEN DIE
EINZELBESTANDTEILE VON
HP 14/30 UND TEILPEPTIDE VON RPH HINSICHTLICH EINER IN VITRO-
ADHAERENZHEMMUNG
VON M. PNEUMONIAE 76
3.2.1 TESTUNG DER MONOSPEZIFISCHEN ANTISEREN VON RP14, RP30 UND HP14/30
IM
FACS-BASIERTEN IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST 77
3.2.2 IDENTIFIZIERUNG ADHAERENZ-VERMITTELNDER BEREICHE DES RP14-PROTEINS
78
3.2.2.1 HETEROLOGE GENEXPRESSION DER VON RP14 ABGELEITETEN TEILPEPTIDE
78
3.2.2.2 IMMUNOREAKTIVITAET DER TEILPEPTIDE VON RP14 UND DEREN MOEGLICHE
BINDUNG AN
HELA-ZELLEN IN VITRO 79
3.2.2.3 HEMMUNG DER ADHAERENZ VON M. PNEUMONIAE DURCH DIE
MONOSPEZIFISCHEN
ANTISEREN GEGEN RP14 UND DIE ABGELEITETEN TEILPEPTIDE 81
3.3 VERWENDUNG VON HP14/30 FUER DIE SERODIAGNOSTIK VON M.
PNEUMONIAE-INFEKTIONEN
BEIM MENSCHEN 82
3.4 UNTERSUCHUNG DER GENEXPRESSION DER ADHAESINE PI, P30 UND DEM
ADHAERENZ-
ASSOZIIERTEN PROTEIN P90 VON M. PNEUMONIAE NACH DEM KONTAKT MIT HUMANEN
EPITHELZELLEN (HELA-ZELLEN) 86
3.5 OPTIMIERUNG DER IMMUNANTWORT GEGEN DAS HYBRIDPROTEIN 14/30 DURCH
IMMUNISIERUNGSEXPERIMENTE IM TIERMODELL MEERSCHWEINCHEN 91
3.5.1 FREISETZUNGSVERHALTEN DES HP14/30-CHITOSANKOMPLEXES IN VITRO 91
3.5.2 VORVERSUCH ZUR ERMITTLUNG DER ANTIGENDOSIS IN KOMBINATION MIT
CHITOSAN FUER
EINE OPTIMIERTE IMMUNANTWORT NACH INTRANASALER IMMUNISIERUNG 92
3.5.2.1 IMMUNOBLOT ANALYSE DES SERUMS UND DER RESPIRATORISCHEN PROBEN 92
3.5.2.2 QUANTITATIVE MESSUNG DER IMMUNANTWORT GEGEN HP14/30 IM SERUM 94
3.5.2.3 QUANTITATIVE MESSUNG VON ANTI-HP 14/30-IGA IM RESPIRATIONSTRAKT
95
3.5.2.4 FACS-BASIERTER IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST ZUM VORVERSUCH 97
F
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.3 HAUPTVERSUCH 1: UNTERSUCHUNG VERSCHIEDENER IMMUNISIERUNGSABLAEUFE
UND
IMMUNISIERUNGSFORMULIERUNGEN AUF DIE IMMUNANTWORT GEGEN HP 14/30 98
3.5.3.1 IMMUNOBLOT-ANALYSE DES SERUMS UND DER RESPIRATORISCHEN PROBEN 98
3.5.3.2 QUANTITATIVE MESSUNG DER IMMUNANTWORT GEGEN HP14/30 IM SERUM 100
3.5.3.3 QUANTITATIVE MESSUNG VON ANTI-HP 14/30-IGA IM RESPIRATIONSTRAKT
101
3.5.3.4 FACS-BASIERTER IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST ZUM HAUPTVERSUCH 1 105
3.5.3.5 UNTERSUCHUNG DER GENEXPRESSION VON CYTOKINEN IN MILZ UND LUNGE
VON
MEERSCHWEINCHEN NACH IMMUNISIERUNG MIT HP 14/30 IM HAUPTVERSUCH 1 .. 106
3.5.4 HAUPTVERSUCH 2: VERGLEICH DER IMMUNANTWORT NACH ZWEI ODER DREI
INTRANASALEN
BOOSTER-IMMUNISIERUNGEN MIT HP 14/30 UND LANGZEITSTUDIE DER HUMORALEN
IMMUNANTWORT 109
3.5.4.1 IMMUNOBLOT-ANALYSE DES SERUMS UND DER RESPIRATORISCHEN PROBEN
109
3.5.4.2 QUANTITATIVE MESSUNG DER IMMUNANTWORT GEGEN HP14/30 IM SERUM 111
3.5.4.3 QUANTITATIVE MESSUNG VON ANTI-HP14/30-IGA IM RESPIRATIONSTRAKT
112
3.5.4.4 FACS-BASIERTER IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST ZUM HAUPTVERSUCH 2 115
3.5.5 HAUPTVERSUCH 3: INTRANASALE INFEKTION DER VERSUCHSTIERE MIT M.
PNEUMONIAE NACH
VORANGEGANGENER IMMUNISIERUNG 116
3.5.5.1 IMMUNOBLOT-ANALYSE DES SERUMS UND DER RESPIRATORISCHEN PROBEN
116
3.5.5.2 QUANTITATIVE MESSUNG DER IMMUNANTWORT GEGEN HP14/30 UND M.
PENUMONIAE-GESAMTANTIGEN IM SERUM 118
3.5.5.3 QUANTITATIVE MESSUNG VON ANTI-HP 14/30-IGA IM RESPIRATIONSTRAKT
121
3.5.5.4 FACS-BASIERTER IN VITRO- ADHAERENZHEMMTEST ZUM HAUPTVERSUCH 3 123
3.5.5.5 ERREGERLAST DER VERSUCHSTIERGRUPPEN 8 UND 10 IM
RESPIRATIONSTRAKT NACH
INFEKTION MIT M. PNEUMONIAE 124
4 DISKUSSION 128
G
INHALTS VERZEICHN IS
4.1 IMMUNANTWORT VON MEERSCHWEINCHEN NACH EINER INTRANASALEN INFEKTION
MIT M
PNEUMONIAE 128
4.2 CHARAKTERISIERUNG DES RP14-PROTEINTEILBEREICHES VON HP 14/30 131
4.3 HP 14/30 FUER DIE SERODIAGNOSTIK HUMANER M. PNEUMONIAE-INFEKTIONEN
134
4.4 GENEXPRESSIONSPROFIL DER ADHAESINE PI, P30 UND DEM
ADHAERENZ-ASSOZIIERTEN PROTEIN
P90 NACH DEM KONTAKT MIT HUMANEN WIRTSZELLEN 135
4.5 UNTERSUCHUNG DER IMMUNANTWORT GEGEN DAS HYBRIDPROTEIN 14/30 UND DER
DAMIT
VERBUNDENEN PROTEKTIVITAET IM INFEKTIONSMODELL 138
5 LITERATURVERZEICHNIS I
6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS XIX
7 TABELLENVERZEICHNIS XXIX
8 ANHANG A
9 DANKSAGUNG MM
10 VERSICHERUNG NN
H
|
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