CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Würzburg
Julius-Maximilians-Univ.
2014
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Schlagworte: | |
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Beschreibung: | III, 82 S. Ill., graph. Darst. |
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adam_text | AUS DER ABTEILUNG FUER MOLEKULARE INNERE MEDIZIN
DER MEDIZINISCHEN KLINIK UND POLIKLINIK II
DER UNIVERSITAET WUERZBURG
LEITER DER ABTEILUNG: PROF. DR. HARALD WAJANT
CD40-RESTRINGIERTE AKTIVIERUNG DER TRAIL-
TODESREZEPTOREN DURCH BIFUNKTIONELLE
REKOMBINANTE PROTEINE
INAUGURAL - DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE DER
MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER
JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
RUTH INGEAUMUELLER
AUS LANDSHUT
WUERZBURG, MAI 2014
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 LIGANDEN DER TNFSF 1
1.2 REZEPTOREN DER TNFSF 2
1.3 TRAIL UND SEINE REZEPTOREN 5
1.3.1 TRAIL 5
1.3.2 TRAIL-REZEPTOREN 5
1.3.2.1 TODESREZEPTOREN FUER TRAIL: TRAILR1 UND TRAILR2 6
1.3.2.2 KOEDERREZEPTOREN FUER TRAIL: TRAILR3, TRAILR4 UND OPG 7
1.4 TRAIL-VERMITTELTE INTRAZELLULAERE SIGNALWEGE 8
1.4.1 TRAIL-VERMITTELTE APOPTOSE 8
1.4.2 INHIBITORISCHE PROTEINE DER APOPTOSE 10
1
.4
.3 TRAIL-VERMITTELTE
NFKB
-, JNK- UND P38MAPK-AKTIVIERUNG 12
1.5 DIE ROLLE VON TRAIL IM IMMUNSYSTEM 14
1.6 CD40 UND SEIN LIGAND CD40L 15
1.6.1 CD40 15
1.6.2 CD40L 16
1.7 CD40-VERMITTELTE INTRAZELLULAERE SIGNALWEGE 16
1.8 DIE ROLLE VON CD40 IM IMMUNSYSTEM 17
1.9 ZIEL DER ARBEIT 19
2 MATERIALIEN 20
2.1 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN, ZELLKULTURMEDIEN 20
2.2 ANTIKOERPER UND ANTISEREN 21
2.3 EUKARYOTISCHE ZELLEN 22
2.4 PLASMIDE 22
2.5 LOESUNGEN UND PUFFER 22
2.6 GERAETE, VERBRAUCHSMATERIALIEN 23
2.7 KITS 24
3 METHODEN 25
3.1 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN ZELLLINIEN 25
3.1.1 KULTIVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN 25
3.1.2 KONSERVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN 25
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 PRODUKTION REKOMBINANTER PROTEINE 25
3.2.1 PRODUKTION REKOMBINANTER PROTEINE DURCH TRANSIENTE
TRANSFEKTION VON HEK293-ZELLEN 25
3.2.2 PRODUKTION REKOMBINANTER PROTEINE MITHILFE STABIL TRANSFIZIERTER
HEK293-ZELLEN 26
3.3 AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 26
3.4 ZYTOTOXIZITAETSASSAY 27
3.5 BESTIMMUNG DER IL8-PRODUKTION 27
3.6 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN 28
3.7 WESTERN BLOT 29
3.7.1 SDS-PAGE 29
3.7.2 TRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSE 29
3.7.3 IMMUNDETEKTION 29
3.8 SILBERFAERBUNG 30
3.9 NACHWEIS ZYTOTOXISCHER AKTIVITAET AM DIGITALEN LICHTMIKROSKOP 31
4 ERGEBNISSE 32
4.1 GENERIERUNG REKOMBINANTER TRAIL-FUSIONSPROTEINE 32
4.2 PRODUKTION UND REINIGUNG DES REKOMBINANTEN FUSIONSPROTEINS
SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL 33
4.3 VERGLEICH DER AKTIVITAET VON GEREINIGTEM UND UNGEREINIGTEM
SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL 35
4.4 BEDEUTUNG DER BINDUNG DER SCFV:CD40-DOMAENE AN
ZELLSTAENDIGES CD40 FUER DIE AKTIVITAET DES TRAIL-FUSIONSPROTEINS 36
4.4.1 BLOCKADE DES CD40-REZEPTORS VERMINDERT DIE AKTIVITAET VON
SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL 36
4.4.2 IN CD40-EXPRIMIERENDEN, NICHT ABER IN CD40-NEGATIVEN ZELLEN,
INDUZIERT SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL DOSISABHAENGIG APOPTOSE... 39
4.5 SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL AKTIVIERT DEN NFKB-SIGNALWEG 41
4.6 VISUALISIERUNG MORPHOLOGISCHER MERKMALE DER APOPTOSE IN
SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL STIMULIERTEN CD40-EXPRIMIERENDEN
TUMORZELLEN 43
4.7 SCFV:CD40-FLAG-SCTRAIL AKTIVIERT IMMOBILISATIONSABHAENGIG DIE
APOPTOSE
V
45
4.8 DETEKTION CHARAKTERISTISCHER CASPASESUBSTRATE 48
5 DISKUSSION 51
II
INHALTSVERZEICHNIS
5.1 SCFV:CD40-TRAIL AKTIVIERT CD40-RESTRINGIERT DIE
TODESREZEPTOREN TRAILR1 UND TRAILR2 51
5.2 EIN ALTERNATIVES TRAIL-KONSTRUKT BESITZT
IMMOBILISATIONSABHAENGIG ZYTOTOXISCHE FAEHIGKEITEN 55
5.3 PERSPEKTIVE DES MAB CD40 IN DER ANTI-TUMOR-FORSCHUNG 56
5.4 EINSCHRAENKUNGEN DER ANWENDUNG VON SCFV:CD40 UND TRAIL IN
DER KREBS-THERAPIE 57
6 ZUSAMMENFASSUNG 59
7 LITERATURVERZEICHNIS 61
8 ANHANG 70
8.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 70
8.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 75
8.3 TABELLENVERZEICHNIS 76
8.4 DNA- UND AMINOSAEURESEQUENZEN DER FUSIONSPROTEINE 76
8.4.1 SCFV:CD40-FLAG-TNC-TRAIL 76
8.4.2 SCFV:CD40-FC-FLAG-GPL 78
8.4.3 SCFV:CD40-FLAG-SCTRAIL 80
9 DANKSAGUNG 1
III
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