Lokalisation und Expression des Östrogenrezeptors alpha und Zusammenhang zwischen der mitotischen Aktivität der Spermatogonien und dem peripheren Östrogenwert im menschlichen Hoden mit normaler und gestörter Spermatogenese:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2014
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Ausgabe: | 1. Aufl. |
Schriftenreihe: | Edition Scientifique
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | 151 S. Ill., graph. Darst. |
ISBN: | 9783835961753 |
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adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 14
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 15
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 18
TABELLENVERZEICHNIS 20
1 EINLEITUNG UND ZIELE 21
2 LITERATURUEBERSICHT 23
2.1 FUNKTION, LAGE UND AUFBAU DES MENSCHLICHEN HODENS 23
2.2 HISTOLOGIE DES MENSCHLICHEN HODENS 23
2.2.1 KEIMZELLEN 24
2.2.2 SERTOLI-ZELLEN 25
2.2.3 LEYDIG-ZELLEN 26
2.2.4 PERITUBULAERE MYOIDZELLEN 27
2.3 ABLAUF DER NORMALEN SPERMATOGENESE 27
2.4 KINETIK DER HUMANEN SPERMATOGENESE 29
2.5 STOERUNGEN DER HUMANEN SPERMATOGENESE 30
2.6 OESTROGENE 33
2.6.1 BIOSYNTHESE 34
2.6.2 WIRKUNGSWEISE 35
2.6.3 OESTROGENWERTE IM BLUT 36
2.6.4 EINFLUSS VON OESTROGENEN AUF SPERMATOGENESE UND FERTILITAET 36
2.7 OESTROGENREZEPTOREN (ERS) 37
2.8 ZELLULAERE LOKALISATION UND EXPRESSION DES ERA IM HODEN 39
2.9 ZELLZYKLUS UND PROLIFERATIONSMARKER KI-67 42
3 MATERIAL UND METHODEN 44
3.1 PROBENUMFANG 44
3.2 PROBENGEWINNUNG 46
3.2.1 HERSTELLUNG HISTOLOGISCHER SCHNITTPRAEPARATE (PARAFFINSCHNITTE) 46
3.2.1.1 FIXATION IN BOUIN SCHER LOESUNG 46
9
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.2 ENTWAESSERUNG DER PROBEN 46
3.2.1.3 EINBETTUNG DER PROBEN 47
3.2.1.4 BESCHICHTUNG DER OBJEKTTRAEGER (OT) 47
3.2.1.5 HERSTELLUNG DER PARAFFINSCHNITTE 47
3.2.1.6 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG (H.E.-FAERBUNG) 48
3.2.2 HERSTELLUNG HISTOLOGISCHER SCHNITTPRAEPARATE (GEFRIERSCHNITTE) 49
3.2.2.1 VORBEREITUNGEN 49
3.2.2.2 HERSTELLUNG DER GEFRIERSCHNITTE 49
3.2.2.3 FIXATION DER GEFRIERSCHNITTE SO
3.3 NACHWEIS DER ERA-EXPRESSION MITTELS RT-PCR NACH UV-LAM SO
3.3.1 UV-LAM 50
3.3.2 RNA-EXTRAKTION AUS MIKRODISSEKTIERTEM GEWEBE MIT
DEM RNEASY MICRO KIT (CAT.NO. 74004) 51
3.3.3 RT-PCR 52
3.3.3.1 DNASE-VERDAU 52
3.3.3.2 REVERSE TRANSKRIPTION (RT) 53
3.3.3.3 PCR 54
3.3.3.4 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE 55
3.4 NACHWEIS DER ZELLULAEREN LOKALISATION DES ERA AUF MRNA-EBENE
MITTELS IN-7-HYBRIDISIERUNG (ISH) 56
3.4.1 HERSTELLUNG DIGOXIGENIN-MARKIERTER CRNA-SONDEN 56
3.4.1.1 EXTRAKTION UND ISOLATION VON RNA AUS GEFRIERMATERIAL.... 56
3.4.1.1.1 VORBEREITUNGEN 56
3.4.1.1.2 RNA-EXTRAKTION MIT TRLZOL REAGENT 57
3.4.1.1.3 ISOLATION DER RNA 57
3.4.1.1.4 RT-PCR 58
3.4.1.1.5 AUFREINIGUNG DES PCR-FRAGMENTES 58
3.4.1.1.6 KLONIERUNG 59
3.4.1.1.7 PLASMID-EXTRAKTION MIT DEM QIAPREP SPIN
PLASMID KIT 61
3.4.1.1.8 HERAUSSCHNEIDEN DES ERA-INSERTS AUS DEM
PLASMID MIT HILFE VON NOT-I (ANTISENSE)
UND NCO-I (SENSE) 62
3.4.2 ISH ERA 63
10
INHALTSVERZEICHNIS
3.5 NACHWEIS DER ZELLULAEREN LOKALISATION DES ERA MITTELS
IMMUNHISTOCHEMIE (IHC) 66
3.6 VERIFIZIERUNG DER ZYTOPLASMATISCHEN ERA-LOKALISATION MITTELS RT-PCR
68
3.6.1 RNA-EXTRAKTION AUS PARAFFINGEWEBE MIT DEM RNEASY
FFPE KIT (CAT.NO. 74404) 69
3.6.2 RNA-MESSUNG 70
3.6.3 RT-PCR 70
3.7 CHARAKTERISIERUNG IMMUNOPOSITIVER INTERSTITIELLER ZELLEN NACH
ERO-LHC (HC-20) UND UV-LAM MITTELS RT-NESTED-PCR 71
3.7.1 HERSTELLUNG HISTOLOGISCHER SCHNITTPRAEPARATE (PARAFTINSCHNITTE)
FUER DIE IHC 71
3.7.2 IHC ERA 71
3.73 UV-LAM 71
3.7.4 RNA-EXTRAKTION AUS MIKRODISSEKTIERTEM GEWEBE MIT DEM
RNEASY PLUS MINI KIT (CAT.NO. 74134) 72
3.7.5 REVERSE TRANSKRIPTION 72
3.7.6 NESTED-PCR 73
3.8 NACHWEIS DER ERA-EXPRESSION AUF PROTEINEBENE MITTELS
IMMUNOBLOT ANALYSE (IB) 74
3.8.1 EXTRAKTION UND ISOLATION DER PROTEINE 74
3.8.2 IB ERA 75
3.8.2.1 PROBENVORBEREITUNG 75
3.8.2.2 GELELEKTROPHORESE UND ELEKTROBLOTTING 75
3.8.2.3 IMMUNBESTIMMUNG 76
3.9 NACHWEIS DER ERA-, ERSS- UND GPER-EXPRESSION MITTELS
QUANTITATIVER RT-PCR (RT-QPCR) 77
3.9.1 HERSTELLUNG HISTOLOGISCHER SCHNITTPRAEPARATE (PARAFTINSCHNITTE)
FUER DIE EXTRAKTION VON RNA AUS PARAFTINMATERIAL 77
3.9.2 RNA-EXTRAKTION AUS PARAFFINGEWEBE MIT DEM RNEASY
FFPE KIT (CAT.NO. 74404) 77
3.9.3 EINSTELLUNG DER RNA 77
3.9.4 RT-PCR 78
3.9.5 QPCR 79
3.9.5.1 CDNA-VERDUENNUNGSREIHE 79
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.9.5.2 GENEXPRESSIONSVERGLEICH UNTERSCHIEDLICHER
HODENBIOPSIEN 82
3.9.5.3 STATISTISCHE VERFAHREN 83
3.10 NACHWEIS DES PROLIFERATIONSMARKERS KI-67 MITTELS IHC 83
3.11 BESTIMMUNG DES PERIPHEREN OESTROGENWERTES 85
3.12 HISTOMORPHOMETRISCHE ANALYSE AN KI-67-GEFAERBTEN PARAFFINSCHNITTEN
UND KORRELATION MIT DEM PERIPHEREN OESTROGENWERT 85
4 ERGEBNISSE 87
4.1 RT-PCR ERA NACH UV-LAM 87
4.1.1 NORMALE SPERMATOGENESE 87
4.1.2 SERTOLI CELL ONLY-SYNDROM 87
4.2 ISH ERA 89
4.3 IHC ERO 90
4.3.1 HC-20-ANTIKOERPER 90
4.3.2 F-10-ANTIKOERPER 90
4.3.3 H-184-, 1F3-, 1D5- UND 60C-ANTIKOERPER 93
4.4 RT-PCR VON PARAFFINSCHNITTEN MIT NSP UND TIN 94
4.5 RT-NESTED-PCR 95
4.5.1 ERA 95
4.5.2 STAR 95
4.6 IB ERA 97
4.6.1 HC-20-ANTIKOERPER 97
4.6.2 F-10-ANTIKOERPER 98
4.6.3 H-184-, 1F3-, 1D5- UND 60C-ANTIKOERPER 99
4.7 RT-QPCR ERA 100
4.8 RT-QPCR ERA, ERSS UND GPER IM VERGLEICH 102
4.9 IHC KI-67 104
4.10 HISTOMORPHOMETRISCHE ANALYSE AN KI-67-GEFAERBTEN PARAFFINSCHNITTEN
UND ZUSAMMENHANG ZWISCHEN MITOTISCHER AKTIVITAET UND PERIPHEREM
OESTROGENWERT 105
12
INHALTSVERZEICHNIS
5 DISKUSSION 108
6 ZUSAMMENFASSUNG 117
7 SUMMARY 119
8 LITERATURVERZEICHNIS 121
9 ANHANG 134
9.1 PUFFER, NAEHRBOEDEN UND LOESUNGEN 134
9.2 BEZUGSQUELLEN 142
9.2.1 REAGENZIEN 142
9.2.2 GERAETE 147
9.2.3 SONSTIGE MATERIALIEN 148
9.2.4 SOFTWARE 149
10 DANKSAGUNG. ISO
13
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